[发明专利]一种巴氯芬人工半抗原、人工抗原及其制备方法和应用

说明书

本发明公开了一种巴氯芬人工半抗原、人工抗原及其制备方法和应用。巴氯芬人工半抗原的分子结构式如式(Ⅰ)，巴氯芬人工抗原的分子结构式如式(Ⅱ)。本发明的巴氯芬人工半抗原最大程度地保留了巴氯芬的特征结构，且具有可以与载体蛋白发生偶联的活性基团，可作为抗原决定簇；进一步制备获得的巴氯芬人工抗原可免疫获得亲和力高、灵敏度高、特异性强的抗巴氯芬抗体，经免疫新西兰白兔获得的免疫血清的效价高达1∶80000，可用于对巴氯芬进行快速、准确的免疫检测和免疫分析。

技术领域

本发明属于生物化工技术领域，具体涉及一种巴氯芬人工半抗原、人工抗原及其制备方法和应用。

背景技术

巴氯芬为骨骼肌松弛药，用于改善锥体束损害造成的肌张力增高的痉挛症状、不同原因造成的痉挛性偏瘫和截瘫，如多发性硬化、脑血管病、脊髓损伤和脊髓炎后遗症、儿童脑性瘫痪、破伤风、难治性呃逆等。

本药口服从胃肠道迅速、完全吸收。口服后1～3h，血浆浓度到达高峰，但个体差异较大。70％～80％药物以原形从小便排出，约15％由肝脏代谢。

长期使用突然停药可引起：停药综合征、头昏、头痛、乏力、幻觉、癫痫、腹泻、便秘、皮疹、食欲减退、低血压、恶心、呕吐、欣快、精神忧郁、失眠、耳鸣、麻木、谈话含糊、肝功能损害、震颤等症状。

目前，对巴氯芬的检测主要依靠高效液相色谱法(HPLC)、气相色谱法(GC)、薄层色谱法(TLC)、质谱法(MS)等，但是存在仪器昂贵，检测费时，并且需要专业技术人员进行操作，不能达到现代检测对快速、准确的要求。因此建立快速、灵敏、准确的检测技术是很有必要的。

免疫分析法可以弥补以上所有缺点，免疫分析法是一种利用抗原抗体特异性结合反应检测各种物质(药物、激素、蛋白质、微生物等)的分析方法，建立小分子化合物的免疫分析方法的关键是能够制造出对小分子化合物具有高亲和力和高特异性的抗体。但是由于包括巴氯芬在内的大多数小分子化合物(分子量小于1000)不具有免疫原性，即缺乏T细胞表位而无法直接诱导动物机体产生特异性抗体，故小分子物质被称为半抗原。通过适当的化学修饰，在半抗原分子结构的某个位置上连上连接臂，再与大分子载体结合，合成半抗原-载体偶联物(即人工抗原)，人工抗原可以借助T细胞表位来间接诱导B细胞的增殖和分化，继而产生特异性抗体。

现有技术中还未有巴氯芬人工半抗原、人工抗原的相关报道。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中存在的缺陷与不足，提供一种巴氯芬-牛血清蛋白人工抗原的制备方法，所制备的巴氯芬-牛血清蛋白人工抗原可进行动物免疫，取得相应的巴氯芬抗体，可用于各种巴氯芬类免疫分析法的研究，为巴氯芬的检测提供更加方便快速准确的途径。

本发明首先提供了一巴氯芬人工半抗原，该巴氯芬人工半抗原最大程度的保留了巴氯芬的特征结构，且具有可以与载体蛋白发生偶联的活性基团，可作为抗原决定簇。

一种巴氯芬人工半抗原，其分子结构式如(Ⅰ)所示：

本发明公开了一种巴氯芬人工半抗原的制备方法，该方法包括以下步骤：

(1)将巴氯酚和三氟乙酸酐按摩尔比1∶1.1混合，加入3A分子筛干燥过的苯，室温下搅拌反应1小时，接着转入80℃油浴中继续搅拌回流3小时，反应结束，冷却至室温，将溶剂减压蒸干得淡黄色油状物A；

(2)将淡黄色油状物A、N-羟基琥珀酰亚胺、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐按摩尔比1∶1.35～1.5∶2.45～3.0混合，加入二氯甲烷溶解，室温搅拌反应18小时；结束反应将反应液转入分液漏斗中，分别用0.1N的盐酸、纯化水、饱和的碳酸氢钠溶液、饱和的食盐水洗涤有机相，取有机相干燥、过滤、减压蒸干得灰白色固体B；