[发明专利]一种快速鉴定向日葵列当抗性基因的方法

权利要求书

1.一种快速鉴定向日葵列当抗性基因的方法，其包括以下步骤：

(1)向日葵复合植物的获得：

(1.1)种子消毒与萌发

选择饱满的向日葵种子用于进行消毒；

将消毒后的种子播种于含有培养基的培养皿中，并置于适宜于种子萌发的环境中萌发培养；

(1.2)外植体分离

选取萌发好的种子，切除接近根一端的一段下胚轴，剩下的种子部分作为外植体用于侵染；

(1.3)侵染与共培养

将外植体浸入农杆菌悬浮液中浸染，然后将外植体转移到培养皿中进行共培养，其中所述共培养进行2到3天，在培养皿中铺有滤纸，且滤纸上含有液体共培养基；

(1.4)筛选培养与根诱导培养

共培养完后，将外植体转移到筛选培养基上培养，并诱导生根，直到获得复合植物；

(2)向日葵列当抗性鉴定：

(2.1)向日葵列当种子的消毒和预培养

对向日葵列当种子进行消毒；

对向日葵列当种子进行预培养，其包括在培养皿底部放置灭菌的滤纸，用无菌水完全湿润滤纸，将经过消毒处理的向日葵列当种子尽量均匀地平铺在滤纸上一段时间，然后用于接种向日葵复合植物和野生型向日葵植物；

(2.2)向日葵复合植物的处理

选取具有健康生长点及具有至少3cm健壮发根的植物，小心地将复合植物从培养基中取出，用清水洗掉残留在根上的培养基，直接用于列当接种；

(2.3)野生型对照向日葵种子的消毒和萌发

挑选饱满的向日葵种子用于进行消毒，然后放在发芽纸中萌发7-10天后用于接种；

(2.4)向日葵列当种子接种

取方形培养皿，然后在底盖中填充混合好的基质，在基质上面覆盖灭菌的方形玻璃纤维滤纸，并用蒸馏水将玻璃纤维滤纸润湿；再将含有预培养的列当的滤纸片覆盖在玻璃纤维滤纸上；最后将向日葵或者向日葵复合植物的根放置在上面，地上部分朝向平皿开口一侧，将上盖盖上并用医用胶带将培养皿封好后放置在培养箱中培养，其中所述基质包括以1:1的蛭石和草炭的组合或者以1:1的蛭石和河沙的组合；

(2.5)GFP表达检测和寄生瘤数量统计

接种一段时间后，用肉眼观察和统计向日葵列当寄生瘤的数量，并在荧光显微镜下检查向日葵复合植物的发根以确认含有寄生瘤的发根均有GFP蛋白表达，

其中所述向日葵复合植物包括转基因发根和非转基因地上部分。

2.根据权利要求1所述的方法，其中在步骤(2.5)中，接种3周后，用肉眼观察和统计向日葵列当寄生瘤的数量，并在荧光显微镜下检查向日葵复合植物的发根以确认含有寄生瘤的发根均有GFP蛋白表达。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中在步骤(1.1)中，所述消毒通过下述方式来进行：用75％的酒精进行表面消毒，然后用次氯酸钠溶液浸泡15分钟，最后用超纯水润洗多次。

4.根据权利要求1或2所述的方法，其中在步骤(1.1)中，所述适宜于种子萌发的环境为处于室温且光照/黑暗替换周期为16/8小时的环境。

5.根据权利要求1或2所述的方法，其中在步骤(1.4)中，在筛选培养阶段，所使用的筛选剂为草铵膦，并且其浓度范围为4-8mg/L。

6.根据权利要求1或2所述的方法，其中在步骤(1.4)中，在筛选培养阶段，在筛选培养一周以后，降低或去除筛选剂，从而短期内增殖发根。

7.根据权利要求1或2所述的方法，其中在步骤(2.1)中，所述消毒通过下述方式来进行：向日葵列当种子用75％酒精溶液表面消毒2分钟，再用0.25％次氯酸钠浸泡消毒，最后用蒸馏水冲洗。

8.根据权利要求1或2所述的方法，其中在步骤(2.1)中，所述向日葵列当种子的预培养包括：在培养皿底部放置两张灭菌的玻璃纤维滤纸，用无菌水完全湿润滤纸，将经过消毒处理的向日葵列当种子尽量均匀地平铺在滤纸上，培养皿用医用胶带密封，在22℃下于黑暗中放置7天，然后用于接种向日葵复合植物和野生型向日葵植物。