[发明专利]一种快速鉴定向日葵列当抗性基因的方法

说明书

本发明涉及植物组织培养和转化以及基因功能鉴定领域，特别地涉及向日葵列当(Orobanche cumana)抗性基因的鉴定。本发明建立了一种基于向日葵发根转化获得复合体而在体外条件下快速鉴定向日葵列当抗性基因的方法。

技术领域

本本发明属于生物技术领域，涉及一种基于向日葵发根复合体系在体外条件下快速鉴定向日葵列当抗性基因的方法。

背景技术

向日葵列当(Orobanche cumana Wallr.)又称毒根草或兔子拐棍，是一年生草本植物，其属双子叶植物中的列当科。它是向日葵特有的非光合根寄生植物，对向日葵的生长发育有负面影响⁽¹⁾。受感染的植株矮小、瘦弱、花盘直径变小或不能形成花盘，最后导致全株枯死⁽²⁾。欧洲和亚洲，列当危害造成的减产超过80％⁽³⁾。

有几种方法可以或多或少地控制列当，例如可使用不同的作物管理解决方案：土壤暴晒，生物控制，和使用除草剂例如咪唑啉酮与耐除草剂向日葵杂交种组合使用。培育抗性品种控制列当是一项最经济有效，简单易行的防治措施⁽⁴⁾。然而，这是一项长期的工作，因为当最新的一个小种的抗性被发现时，列当会进化出一个更具毒力的小种，抗性就会随之逐步减弱或消失。因此，为了加速向日葵列当抗性品种的育种进程和提高抗列当育种效率，现代作物分子育种成为抗列当向日葵育种的关键技术之一。

许多遗传作图研究已经分析了向日葵对列当的数量抗性，并且已经证明了一些数量性状基因座对一个或多个发育阶段是特异的，或者控制了列当的萌发数量⁽⁵⁾。遗传抗性基因最初从野生向日葵属物种(Helianthus spp.)中鉴定并通过种间杂交导入易感品种⁽⁶⁾。按基因对列当生理小种的反应命名了不同的Or抗性基因，并已经在育种中应用了几十年⁽⁷⁾。然而，关于抗性基因座的分子遗传学定位，目前只有两篇报道。第一个是Or5基因，该基因对E小种具有抗性^(8-10)。第二个报告详细描述了对F小种的抗性QTL定位，在5个连锁群(LG)上检测到了6个控制田间出现的小种数量的QTL，未克隆到任何基因，以及与抗性相关的分子机制仍然未知。因此，进一步筛选和鉴定抗性候选基因对于加快向日葵列当抗性品种的育种进程具有十分重要的意义。

转基因互补实验是基因功能验证的方法之一，即将候选基因如抗病性状转入感病的个体中进行表型鉴定来确定基因功能。最常用的植物转化方法有农杆菌介导转化和基因枪法等⁽¹¹⁾。向日葵的转化非常具有挑战性，国内外都有许多尝试，但是转化效率都不高，并且可重复性比较低⁽¹²⁾。另外转化过程非常繁琐，培养时间长，成本高，限制了它们作为列当抗性基因功能研究对象的潜力。发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)介导的转化系统可以在相对较短的时间(约5-6周)来完成候选基因的功能验证。而且系统产出效率更高，因为每个转基因根代表一个独立的转化事件，在相对较短的时间内可以获得和分析大量的转化子。发根农杆菌介导的转化方法简便快捷，已成为基因功能和根生物学研究的有力工具⁽¹³⁾。发根转化尤其适合应用于涉及到根系生物学的基因功能研究，如那些在共生和致病相互作用、营养吸收和激素转运中起作用的基因⁽¹⁴⁾。在大豆上，菌株K599能有效地诱导多个大豆品种子叶产生毛状根，其离体培养的毛状根可用于大豆胞囊线虫的繁殖，为大豆胞囊线虫的功能研究提供了一种简便有效的工具⁽¹⁵⁾。向日葵列当根寄生的特性决定了发根转化系统非常适合列当抗性基因的验证。