[发明专利]一种基于CCDC39基因CNV检测辅助选择黄牛生长性状的方法

说明书

本发明公开了一种基于CCDC39基因CNV检测辅助选择黄牛生长性状的方法：以黄牛基因组DNA为模板进行实时荧光定量PCR，利用一对特异性引物扩增CCDC39基因的拷贝数变异区域的部分片段，同时利用另外一对特异性引物扩增BTF3基因部分片段作为参考，根据2*2^‑ΔΔCt的方法计算并判定个体的拷贝数变异类型。与黄牛生长数据的关联分析显示，所检测的CCDC39基因拷贝数变异对黄牛的体重有显著影响，其中缺失型个体的体重显著高于正常型和多拷贝型个体。本发明提供的方法有利于加快黄牛分子标记辅助选择育种工作的进行。

技术领域

本发明涉及黄牛生长性状标记辅助选择领域，具体涉及CCDC39基因拷贝数变异的检测。

背景技术

随着基因组学和生物信息学等学科的迅猛发展，动物育种理论和技术正在发生重大变化，肉牛育种的方向由宏观表型选育向微观分子育种发展。目前，牛分子育种研究主要集中在以分子标记为基础的标记辅助选择方面。分子育种，即分子标记辅助选择(molecular mark-assist selection,MAS)，该技术是借助DNA分子标记对遗传资源或育种材料进行选择，对畜禽的综合性状进行品种改良。在畜禽育种中，通过对生长性状密切相关的DNA标记的选择，达到早期选种和提高育种值准确性的目的，从而在畜禽育种中获得更大的遗传进展。

拷贝数变异(Copy Number Variations,CNVs)是一种基因组亚显微水平结构的变异类型，是指基因组DNA中较大片段的缺失或重复现象，涉及的片段大小在100bp到数Mb之间，包括拷贝数增加(Copy number gain)和拷贝数减少(Copy number loss)。有些拷贝数变异通过改变基因序列和含量来影响基因表达，造成表型差异和表型适应，有些则属于多态性范畴，并不会对动植物的表型造成影响。

全基因组范围内寻找CNV的方法主要有比较基因组杂交(CGH)、SNP芯片和重测序。其中前两种方法主要基于芯片技术。CGH技术是基于微阵列技术的比较基因组杂交，通过在一张芯片上用标记不同荧光素的样品(试验样本与对照样本)同时进行杂交可检测试验样本基因组和对照基因组间DNA拷贝数的变化。CGH芯片的探针可覆盖整个基因组，在全部染色体或染色体亚带水平上，对不同基因组之间DNA序列的拷贝数进行检测，所以这种分析方法是高通量分析法，且具有敏感度、准确度、分辨率高的特点，分析所得的试验数据有较高的可信度。然而该技术分辨率在Mb水平，更小片段的拷贝数片段则不易检出。同时该技术操作繁琐，通量低、耗时长且成本昂贵，需要较为大量的模板DNA，不利于大范围的推广。SNP芯片不需要同时使用两个样本的DNA和探针进行双杂交，仅使用单杂交就可以完成。它可以通过比较测试样本的信号强度与其他个体的强度，而确定每个位点的相对基因组拷贝数。重测序克服了杂交固有的一些缺点，不需要更多的背景知识和设计工作，应用配对测序可以鉴定出复杂的结构变化。

对于已确定的CNV的检测，通常是采用基于PCR技术和杂交技术的方法。例如实时荧光定量PCR(QPCR)、多重连接探针扩增技术(MLPA)、荧光原位杂交技术(FISH)、Southern印记杂交(Southern blotting)和多重可扩增探针杂交(MAPH)。其中，以实时荧光定量PCR(QPCR)最为常用。根据QPCR所使用的荧光化学方法的不同，主要分为荧光染料嵌入法和荧光杂交探针法两类。荧光染料嵌入法是在PCR反应体系中加入过量的SYBR Green染料分子，能特异性地渗入DNA双链并发射荧光信号，而游离的染料分子则仅有很低的荧光本底几乎不发光，从而确保信号的增加与PCR产物的增加同步，可通过检测荧光信号的强度来反映基因组DNA的数量。通过对目的基因(具有拷贝数变异)及参考基因(无拷贝数变异)进行相对定量，根据2*2^-ΔCt方法统计检测样本候选基因的拷贝数。

CCDC39又名FAP59、CILD14，是一个重要的蛋白编码基因。该基因编码的蛋白参与纤毛和鞭毛的运动，广泛表达于睾丸(RPKM 5.3)、淋巴结(RPKM 2.5)等组织，并且对调节纤毛搏动的动力蛋白的调节和臂内动力蛋白复合物的组装至关重要。目前，尚未见有关CCDC39基因拷贝数变异对云岭牛生长性状影响的文献报道。