[发明专利]一种L-叔亮氨酸的生物制备方法

权利要求书

1.一种L-叔亮氨酸的生物制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1.利用共表达有亮氨酸脱氢酶LDH基因和异丙醇脱氢酶IPDH基因的大肠杆菌细胞，按照细胞湿重5-20g/L与含有三甲基丙酮酸钠13-130g/L和异丙醇6-60g/L的水溶液混合均匀，氨水调节pH至7.5-8.5，30-35℃条件下搅拌反应1-24h，得反应混合液；

S2.将所述反应混合液过滤得上清液，将所述上清液在室温下超滤浓缩得浓缩液；

S3.将所述浓缩液置于0-4℃中放置8-16h，结晶，得到L-叔亮氨酸粗晶体；

S4.将所述L-叔亮氨酸粗晶体用甲醇冲洗，抽滤，再次结晶，得到L-叔亮氨酸晶体。

2.根据权利要求1所述的L-叔亮氨酸的生物制备方法，其特征在于，所述的亮氨酸脱氢酶LDH基因的碱基序列如SEQ ID NO.1所示。

3.根据权利要求1所述的L-叔亮氨酸的生物制备方法，其特征在于，所述异丙醇脱氢酶IPDH基因的碱基序列如SEQ ID NO.2所示。

4.根据权利要求1所述的L-叔亮氨酸的生物制备方法，其特征在于，所述共表达有亮氨酸脱氢酶LDH基因和异丙醇脱氢酶IPDH基因的大肠杆菌细胞的生物制备方法，包括以下步骤：

(1)在质粒pACYCDuet-1上的Nco I和Not I限制性酶切位点之间，插入基因序列如SEQID NO.1所示的亮氨酸脱氢酶LDH基因，构建重组表达载体pACYC-LDH；

(2)在重组表达载体pACYC-LDH上的BglⅡ和XhoⅠ限制性酶切位点之间，插入基因序列如SEQ ID NO.2所示的异丙醇脱氢酶IPDH基因，构建重组表达载体pACYC-LDH-IPDH；

(2)用重组表达载体pACYC-LDH-IPDH转化大肠杆菌BL21(DE3)，获得重组菌株BL21/pACYC-LDH-IPDH；

(3)重组菌株BL21/pACYC-LDH-IPDH在发酵罐中进行发酵，诱导重组亮氨酸脱氢酶LDH和异丙醇脱氢酶IPDH的表达；

(4)离心，获得共表达有亮氨酸脱氢酶LDH和异丙醇脱氢酶IPDH的大肠杆菌细胞。