[发明专利]一种L-叔亮氨酸的生物制备方法

说明书

本发明属于生物工程技术领域，尤其涉及一种L‑叔亮氨酸的生物制备方法，通过在大肠杆菌中表达亮氨酸脱氢酶LDH基因和异丙醇脱氢酶IPDH基因，利用酶偶联辅酶再生循环全细胞不对称催化制备L‑叔亮氨酸，本发明提供的生物制备方法不需要另外添加辅因子，操作方便，催化剂可反复使用，合成效率高，适合工业化生产。

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，尤其涉及一种L-叔亮氨酸的生物制备方法。

背景技术

L-叔亮氨酸(3-甲基-L-缬氨酸；L-亮氨酸；内白氨基酸；L-2-氨基-3,3-二甲基丁酸)是一种非天然氨基酸，其应用广泛，可以用作营养强化剂，动物饲料添加剂，还可以用作合成活性药物的中间体，合成抗癌药物和生物抑制剂等。目前为止，L-叔亮氨酸的合成方法主要有化学法和生物法两种。化学法主要有酒石酸拆分法和二苯甲酒石酸拆分法，操作步骤繁杂，需要引入化学试剂和进行反复重结晶，产物得率低。在不断发展的今天，人们对于环境和药物的品质需求大大增加，生物法绿色安全，因此利用生物法法合成叔亮氨酸越来越被重视。有研究者用盘尼西林G酰化酶拆分制备L-叔亮氨酸，也有研究者利用(R)-乙内酰脲酶催化(RS)-5-叔丁基乙内酰脲合成L-叔亮氨酸，但都存在产物得率不高的问题。目前，利用氨基酸脱氢酶不对称催化氨化前手性酮制备L-叔亮氨酸是最具有前景的生物合成法。该法具有L-叔亮氨酸光学纯度高，副产物少，工艺操作简单的优点，但反应过程中需要加入大量的昂贵的辅酶，这很大程度上限制了该方法在工业上的应用。

发明内容

有鉴于此，本发明目的在于提供一种L-叔亮氨酸的生物制备方法，通过在大肠杆菌中共表达亮氨酸脱氢酶LDH基因和异丙醇脱氢酶IPDH基因，利用酶偶联辅酶再生循环系统生产L-叔亮氨酸，实现辅酶再生进而与亮氨酸脱氢酶一起参与催化反应，大大降低生产成本。

为解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案是：

(1)利用BLAST系统对亮氨酸脱氢酶LDH基因和异丙醇脱氢酶IPDH基因进行基因同源性分析，得出两个基因序列的一致性在75％以上，两个基因属于同源基因；

(2)利用亮氨酸脱氢酶基因引物LDH-F(5’-CATG CCATGG ATGATTACCGAAAGCGTGAA-3’)、LDH-R(5’-ATAAGAAT GCGGCCGC TTATTTCTGAATTTCTTTTTTGC-3’)进行PCR反应，扩增如SEQ ID NO.1所示的亮氨酸脱氢酶LDH基因序列；

(3)将PCR扩增得到的亮氨酸脱氢酶LDH基因片段导入到经过Nco I和Not I两种酶切割的pACYCDuet-1质粒载体中，构建重组表达载体pACYC-LDH；

(4)利用异丙醇脱氢酶基因引物IPDH-F(GGA AGATCTATGACGGATCGTCTGAAAGGCAAAGTTGCCATCGTG)、IPDH-R(CCG CTCGAGTTACTGGGCGGTATAGCCGCC)进行PCR反应，扩增如SEQ IDNO.2所示的异丙醇脱氢酶的基因序列；

(5)将PCR扩增得到的异丙醇脱氢酶IPDH基因片段导入到经过BglⅡ和XhoⅠ两种酶切割的pACYC-LDH质粒载体中，构建重组表达载体pACYC-LDH-IPDH；

(6)用重组表达载体pACYC-LDH-IPDH转化大肠杆菌BL21(DE3)，获得重组菌株BL21/pACYC-LDH-IPDH；

(7)重组菌株BL21/pACYC-LDH-IPDH在发酵罐中进行发酵，当OD₆₀₀达到0.6-1.5时，加入终浓度为0.1mM的IPTG于20℃下继续培养2-24h，诱导重组亮氨酸脱氢酶LDH基因和异丙醇脱氢酶IPDH基因的表达；

(8)4℃离心，获得共表达有亮氨酸脱氢酶LDH基因和异丙醇脱氢酶IPDH基因的大肠杆菌细胞；