[发明专利]一种大规模快速生产病毒载体的方法

说明书

本发明属于生物领域，尤其涉及一种大规模快速生产病毒载体的方法。该方法包括：S1：使用滤器对含有慢病毒载体的细胞培养液进行过滤澄清；S2：将S1得到的澄清液进行超滤浓缩和换液，得到浓缩后的慢病毒载体；S3：将S2得到的慢病毒浓缩液添加核酸酶进行消化；S4：将S3消化过的样品上样Sepharose 6FF层析柱，收集第一个吸收峰；S5：将S4收集到的样品上样阴离子交换层析柱，使用洗脱液洗脱收集；S6：将S5收集到的样品进行超滤浓缩和换液，即得到慢病毒载体。本发明采用分子筛和离子交换膜层析结合的方式，通过二步纯化工艺即可得到高纯度、高活性且符合生物制品药用标准的慢病毒载体。

技术领域

本发明属于生物领域，尤其涉及一种大规模快速生产病毒载体的方法。

背景技术

基因治疗是指通过将正常基因导入病变细胞或体细胞，表达目的蛋白，用来治疗基因缺陷/异常所引起的相关疾病，从而实现源头性治疗，特别针对部分传统治疗方式疗效不佳的部分适应症。目前基因治疗进展顺利的适应症主要集中于单基因缺陷型遗传病。病毒载体被应用于临床研究也越来越多，常用载体类型包括逆转录病毒、慢病毒、腺病毒、腺相关病毒等。而慢病毒载体因它能够在不需要分裂宿主细胞的情况下转化多种细胞类型。因此，研究人员将其用作临床应用中的基因传递载体。尽管这些载体在许多研究实验室常规使用，但大规模的使用当前良好生产规范(CGMP)方法生产的产品面临一系列挑战，必须考虑到更多使用慢病毒载体的临床试验获得监管部门批准。

由于慢病毒载体在生产过程中始终要保持较高活性滴度，加上其质量影响因素较多，如HCP、DNA、BSA、核酸酶、内毒素等，这对其生产工艺增加了较高的难度。目前慢病毒载体工业化生产工艺有超速离心法和色谱层析纯化法：1)超速离心法：虽然其回收效率高，病毒滴度高；但其缺点也非常明显，处理体积有限，生产工艺较难放大，还会引入其他的有毒物质，如氯化铯、有机溶剂(乙醇或异丙醇)等。2)色谱层析纯化方法：采用的纯化工艺有很多种，二步或三步层析是最常见，大部分的生产工艺流程其操作时间长，成本昂贵，产品回收率低(10-20％)是其生产工艺的不足。

从市场的接受程度和昂贵成本考虑，开发一种生产成本较低、回收效率高，产品质量合格的生产工艺，是未来市场应用的必然需求，同时也是工业化生产并符合GPM级生产制备的需求。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于大规模快速生产慢病毒载体的方法，克服现有技术的不足之处。该方法采用分子筛和离子交换膜层析相结合的方式，通过二步纯化工艺即可得到高纯度高活性的慢病毒载体，并符合生物制品药用标准。本发明的纯化方法操作方便快捷、成本低廉、回收效率高，适合大规模生产且符合GMP级生产制备的需求。

具体的，本发明的技术方案如下：

本发明第一个方面公开了一种生产病毒载体的方法，包括：

S1：使用滤器对含有慢病毒载体的细胞培养液进行过滤澄清；

S2：将S1得到的澄清液进行超滤浓缩和换液，得到浓缩后的慢病毒载体；

S3：将S2得到的慢病毒浓缩液添加核酸酶进行消化；

S4：将S3消化过的样品上样Sepharose 6FF层析柱，收集第一个吸收峰；

S5：将S4收集到的样品上样阴离子交换层析柱，使用洗脱液洗脱收集；

S6：将S5收集到的样品进行超滤浓缩和换液，即得到慢病毒载体。

应该理解，本发明不限于上述步骤，还可以包含其他的步骤，例如在步骤S1之前、步骤S1和S2之间、步骤S2和S3之间、步骤S3和S4之间、步骤S4和S5之间、步骤S5和S6之间、步骤S6之后，还包含其他额外的步骤，而不超出本发明的保护范围。

优选的，在S1中，使用0.65或0.45μm玻璃纤维滤器进行过滤澄清。