[发明专利]一种筛选能将L-氨基酸转化为2-酮酸酶的方法

说明书

本发明属于L‑氨基酸发酵的技术领域。本发明提供一种筛选能将L‑氨基酸转化为2‑酮酸酶的方法，包括如下步骤：用每个亚家族HMM图谱对最终数据库中的序列进行评分获得E值低于0.001的序列；得到属于I和II类的15个AT。本发明的有益效果：AT来源广泛，易于异源表达，无需额外添加昂贵的辅因子；高活性，高立体选择性等优点。

技术领域

本发明涉及2-酮酸、D-氨基酸生物催化合成的技术领域。

背景技术

近些年，代谢工程和合成生物学的发展使L-氨基酸的发酵取得了巨大成功。 2017年全球氨基酸产量约为850万吨，预计到2022年将达到1100万吨。而随着现代生物技术的进一步发展，L-氨基酸的生产成本在持续走低。我国作为氨基酸生产和消费大国，大宗型氨基酸产品长期处于供过于求的状态。因此，使用L- 氨基酸作为初始原料生产高附加值产品成为亟待解决的问题。

2-酮酸作为L-氨基酸合成的直接前体物质在人类和动物的新陈代谢中起着重要的作用，并被广泛应用于医药，食品和农业等领域中。但是目前2-酮酸的合成主要是依赖化学方法，这些方法需要昂贵的催化剂或特殊的起始化合物，从而存在高生产成本和环境不友好等缺点。

采用生物酶法催化天然L-氨基酸转化为2-酮酸在可持续性方面具有突出的优势：可再生资源作为起始原料，温和的反应条件和高原子经济性。基于此，目前发现有四类酶可以催化L-氨基酸生成2-酮酸，即L-氨基酸脱氢酶(LADH)， L-氨基酸氧化酶(LAAO)，L-氨基酸脱氨酶(LAAD)和L-氨基酸氨基转移酶 (AT)。

尽管高效率以及高对映选择性和区域选择性使AT具有参与酶促级联反应和 2-酮酸合成的能力，但是AT一般只接受一组相似氨基酸作为底物，这种底物耐受性阻碍了该技术的广泛应用。此外，某些氨基酸(如苏氨酸，赖氨酸和精氨酸)并没有对应的转氨酶或者一些转氨酶活性较低。因此，如何通过生物信息学手段寻找兼容上述反应体系的新型AT以扩大底物接受范围成为本领域研究的难点。

由于近年来手性非天然氨基酸在制药和农业化学工业中受到越来越多的关注，因此非常需要一种由生产的2-酮酸合成D-氨基酸和N-甲基化氨基酸的经济有效的方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种筛选能将L-氨基酸转化为2-酮酸酶的方法，包括如下步骤：用每个亚家族HMM图谱对最终数据库中的序列进行评分获得E值低于0.001的序列；得到属于I和II类的15个AT。

进一步地，所述最终数据库中的序列的获得方法，包括：将UniprotKB数据库中源自细菌和古细菌的未被研究的AspAT/ARAT和AlaAT序列下载为数据集，然后对数据集去除冗余序列得最终数据库的序列。

进一步地，所述HMM亚家族图谱的建立方法，包括：从Swiss-Port检索已被研究确认的AspAT/ARAT和AlaAT的序列；对这些序列去除冗余，使用 HMMER软件包建立HMM亚家族图谱。

更进一步地，所述去除冗余序列的方法为去除氨基酸个数＞200且与 AspAT/ARAT或AlaAT序列的相似度＜90％的序列。

本发明的有益效果：

1.AT来源广泛，易于异源表达，无需额外添加昂贵的辅因子；高活性，高立体选择性等优点。

2.使用廉价且可再生的底物和辅助因子，无需额外添加其他辅因子再生系统，将不利的化学平衡转移到产物的合成方向，减弱了2-酮戊二酸对转氨酶的抑制作用。

3.反应条件温和(pH 8.0-8.5，30℃)，底物转化率高，目标化合物的HPLC 收率很高(＞92.7％)，且具备高立体选择性(产物ee值＞99％)。

附图说明

图1.L-氨基酸转化为2-酮酸的多酶级联反应图。