[发明专利]一种采用MDCK细胞系增殖禽流感病毒的方法

权利要求书

1.一种采用MDCK细胞系增殖禽流感病毒的方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤一、将DMEM、F12和RPMI1640按照一定比例进行混合均匀，以此为基础培养基并添加FBS，复苏培养贴壁的MDCK细胞，待细胞生长至致密单层后，消化传代；逐步减少FBS比例直至0％；

步骤二、将生长良好的已适应无血清培养的MDCK细胞进行摇床扩大培养，直至驯化为稳定增殖的无血清全悬浮培养型MDCK细胞系；

步骤三、将上述驯化完成的MDCK细胞系接种于生物反应器，完成初级细胞培养；

步骤四、将鸡胚繁殖的禽流感H5N1亚型病毒液接种至致密单层的贴壁MDCK细胞，获得悬浮MDCK细胞培养用种毒；

步骤五、取上述禽流感病毒种毒接种于悬浮MDCK细胞，进行培养；

步骤六、分离并提纯病毒粒子。

2.根据权利要求1所述一种采用MDCK细胞系增殖禽流感病毒的方法，其特征在于，具体包括如下步骤：

步骤一、将DMEM、F12和RPMI1640按照2-3∶1-2∶0.5-1的比例进行混合均匀，以此为基础培养基并添加10-12％FBS，复苏培养贴壁的MDCK细胞，待细胞生长至致密单层后，0.25％EDTA-胰酶消化，传代5-6次；逐步减少含10-12％FBS的DMEM-F12-RPMI1640培养基比例、增加无血清的DMEM-F12-RPMI1640培养基比例，使血清含量逐渐减至0％；

步骤二、将生长良好的已适应无血清培养的MDCK细胞经0.25％EDTA-胰酶消化后，进行摇床培养，转速30-50r/min；待细胞生长速率稳定后传代，逐步扩大培养，并逐步提高摇床转速，直至驯化为稳定增殖的无血清全悬浮培养型MDCK细胞系；

步骤三、将上述驯化完成的MDCK细胞系接种于3-5L生物反应器，接种密度为1-2×10⁶cells/ml，培养条件为温度35-37℃，pH值7.0-7.4，溶氧30％-50％，100-120r/min；扩增至0.5-1×10⁷cells/ml时完成初级细胞培养；

步骤四、将鸡胚繁殖的禽流感H5N1亚型病毒液接种至致密单层的贴壁MDCK细胞，以病毒维持液进行培养；传代5-6次；待细胞病变达80-90％时收集培养上清液，以2500-3500r/min离心10-15min，沉淀弃去，取上清液作为悬浮MDCK细胞培养用种毒；

步骤五、取上述适量贴壁培养MDCK细胞增殖的H5N1亚型禽流感病毒，按照MOI为10^-3-10^-1接种于4.0-5.0×10⁶cells/mL悬浮MDCK细胞，培养条件为34-37℃，pH7.2-7.4，溶氧30％-50％，搅拌转速100-120r/min。

步骤六、接毒后培养48-72h，当细胞活力降至40-70％时分离并提纯病毒粒子。