[发明专利]一种采用MDCK细胞系增殖禽流感病毒的方法

说明书

本发明涉及一种采用MDCK细胞系增殖禽流感病毒的方法，所述方法包括将贴壁的MDCK细胞驯化为稳定增殖的无血清全悬浮培养型MDCK细胞系，然后接种于生物反应器，完成初级细胞培养，制备悬浮MDCK细胞培养用禽流感H5N1亚型病毒种毒，接毒于悬浮MDCK细胞进行培养，分离并提纯病毒粒子。本发明驯化所得细胞传代稳定，细胞形态好、质量高，能够保持对病毒的敏感性和生物学特性，病毒增殖能力强，能有效增殖禽流感病毒株。

技术领域

本发明涉及细胞培养技术领域，具体涉及一种采用MDCK细胞系增殖禽流感病毒的方法。

背景技术

禽流感(Bird Flu或Avian Influenza)是由甲型流感病毒的亚型(也称禽流感病毒)引起的一种急性传染病，严重威胁养殖业和人类健康，并给国民经济带来巨大损失。目前为止，禽流感仍未找到理想的治疗药物，疫苗接种仍是当今防止疫病发生和流行的最有效手段。

用于禽流感疫苗制备的传统鸡胚工艺存在诸多问题，生产周期长、操作繁琐、工作量大、易污染，如遇禽流感大规模爆发，鸡胚的供应存在很大问题。以细胞作为介质是目前疫苗制备的趋势，犬肾(Madin-Darby canine kidney cells，MDCK)细胞由Madin和Darby分离培育建立，培养容易、增殖快、流感病毒感染效率高，是国内外公认的最适合禽流感病毒培养的细胞系。其通常是以贴壁培养生长，细胞之间互相衔接或呈镶嵌状排列，并会在表面集合形成紧密的连接蛋白，从而形成单层贴壁细胞。但是，该培养方式存在一些缺陷，比如贴壁培养受基质表面积限制导致病毒产量下降；贴壁培养过程中换液等程序较为复杂繁琐，血清的使用易受微生物、病毒和支原体等的污染，无血清培养技术是阐明细胞生成、增殖、分化以及基因表达调控的基础问题的有效工具，但即使无血清贴壁培养也只适用于试验研究，不适用于大规模培养，不能满足病毒疫苗等实际生产需要。

因此，寻找一种替代传统工艺增殖禽流感病毒的方法势在必行，有必要提供一种在细胞生长速度、细胞密度以及细胞形态方面都有良好效果的基础上进行病毒扩增的方法，同时优化病毒在细胞中的增殖条件，使病毒能够获得大规模生产。

发明内容

针对现有技术存在的不足，本发明即通过逐步降低血清的方法，驯化MDCK细胞适应全悬浮条件培养，获得可连续传代培养的无血清全悬浮培养型MDCK细胞，用来生产的禽流感病毒不仅产毒高效稳定，病毒血细胞凝集效价高，而且可以安全有效地用于生产人用和兽用疫苗，为规模化生产禽流感及其他病毒类疫苗提供细胞学基础资料。

为实现本发明的上述目的，采用如下技术方案：一种采用MDCK细胞系增殖禽流感病毒的方法，包括如下步骤：

步骤一、将DMEM、F12和RPMI1640按照一定比例进行混合均匀，以此为基础培养基并添加FBS，复苏培养贴壁的MDCK细胞，待细胞生长至致密单层后，消化传代；逐步减少FBS比例直至0％；

步骤二、将生长良好的已适应无血清培养的MDCK细胞进行摇床扩大培养，直至驯化为稳定增殖的无血清全悬浮培养型MDCK细胞系；

步骤三、将上述驯化完成的MDCK细胞系接种于生物反应器，完成初级细胞培养；

步骤四、将鸡胚繁殖的禽流感H5N1亚型病毒液接种至致密单层的贴壁MDCK细胞，获得悬浮MDCK细胞培养用种毒；

步骤五、取上述禽流感病毒种毒接种于悬浮MDCK细胞，进行培养；

步骤六、分离并提纯病毒粒子。

优选的，所述DMEM、F12和RPMI1640是按照2-3∶1-2∶0.5-1的比例进行混合均匀作为基础培养基。

进一步的，所述DMEM、F12和RPMI1640是按照3∶1∶1的比例进行混合均匀作为基础培养基。

优选的，所述消化传代采用0.25％EDTA-胰酶进行消化传代。