[发明专利]一种利用酶催化制备2’-脱氧腺苷纯品的方法

权利要求书

1.一种利用酶催化制备2’-脱氧腺苷纯品的方法，其特征在于包括以下步骤：

A)制备N-脱氧核糖转移酶粗品，先将N-脱氧核糖转移酶重组大肠杆菌菌株接种至发酵培养基中，经诱导蛋白表达发酵，得到N-脱氧核糖转移酶粗品，所述的发酵培养基为TB液体培养基，该TB液体培养基中含有：12g/L的蛋白胨，24g/L的酵母粉，4g/L的甘油，2.31g/L的KH₂PO₄ ，16.43g/L的K₂HPO₄·3H₂O，所述诱导蛋白表达发酵是使用诱导剂诱导蛋白表达发酵，所述诱导剂为异丙基硫代半乳糖苷或者乳糖；

B)制备2’-脱氧腺苷酶催化反应液，将脱氧核糖供体和碱基供体按比例称量后加入反应体系，加入纯化水搅拌混匀，调整反应液温度，加入由步骤A）得到的N-脱氧核糖转移酶粗品搅拌反应并且控制搅拌反应的时间，得到2’-脱氧腺苷酶催化反应液，所述的脱氧核糖供体和碱基供体按比例称量是按摩尔浓度比1∶1~1.5进行称量，其中，脱氧核糖供体底物浓度为100g/L，所述加入由步骤A）得到的N-脱氧核糖转移酶粗品是指按照脱氧核糖供体质量的0.5%~2%加入反应，所述的调整反应液温度是指将反应液温度调整为25℃-60℃；所述控制搅拌反应的时间为3-6h，即HPLC检测脱氧核糖供体底物转化率达到最大值即可停止，所述的脱氧核糖供体为2’-脱氧胸苷，所述的碱基供体为腺嘌呤；

C)制备含2’-脱氧腺苷产品粗液，先对由步骤B）得到的2’-脱氧腺苷酶催化反应液加热，再离心除去不溶物，取上清液即得到含2’-脱氧腺苷产品粗液，所述加热的温度为70-85℃，加热的时间为3-10min；

D)制备2’-脱氧腺苷粗品，先用碱性溶液对由步骤C）得到的含2’-脱氧腺苷产品粗液的pH值进行调整，再放置于低温环境进行结晶，收集结晶后的晶体进行干燥处理，得到2’-脱氧腺苷粗品，所述的对含2’-脱氧腺苷产品粗液的pH值进行调整是将pH值调整为10~13，所述的结晶的温度为0-10℃，结晶的时间为10-16h；

E)制备2’-脱氧腺苷纯品，先将预冷的碱水加入到由步骤D）得到的2’-脱氧腺苷粗品中，再在低温环境下进行搅拌洗杂，然后除去液体，得到固体物并干燥处理，得到2’-脱氧腺苷纯品，所述的预冷的碱水与2’-脱氧腺苷粗品的体积质量比为10~20:1mL/g，所述的预冷的碱水为预冷至3-10℃的10mM NaOH溶液，所述的低温环境是指洗杂体系的温度保持在0-10℃；所述搅拌洗杂的时间为20min~120min；

步骤A）中所述的N-脱氧核糖转移酶重组大肠杆菌菌株是将瑞士乳杆菌中编码N-脱氧核糖转移酶的ntd-2基因经密码子优化后，克隆至大肠杆菌BL21宿主内，构建而成的重组NDT大肠杆菌表达菌株HYNTD-202003，ntd-2基因人工合成序列见序列表中序列1，N-脱氧核糖转移酶氨基酸序列见序列表中序列2，该重组NDT大肠杆菌表达菌株HYNTD-202003保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，该菌株的保藏编号为：CGMCC No.19570。

2.根据权利要求1所述的一种利用酶催化制备2’-脱氧腺苷纯品的方法，其特征在于步骤A)中所述的N-脱氧核糖转移酶粗品为含有N-脱氧核糖转移酶的大肠杆菌发酵菌体、含有发酵菌体细胞破碎液或者含有发酵菌体细胞破碎液的冻干粉的N-脱氧核糖转移酶的粗品。

3.根据权利要求1所述的一种利用酶催化制备2’-脱氧腺苷纯品的方法，其特征在于步骤C）中所述的离心为采用离心设备进行固液分离。

4.根据权利要求1所述的一种利用酶催化制备2’-脱氧腺苷纯品的方法，其特征在于步骤D）中所述的碱性溶液为氨水、饱和氢氧化钠溶液或碳酸钠溶液。

5.根据权利要求1所述的一种利用酶催化制备2’-脱氧腺苷纯品的方法，其特征在于步骤D）中所述的干燥处理为烘干或冷冻干燥。