[发明专利]一种利用酶催化制备2’-脱氧腺苷纯品的方法

说明书

一种利用酶催化制备2’‑脱氧腺苷纯品的方法，将N‑脱氧核糖转移酶重组大肠杆菌菌株接种至发酵培养基中，经诱导蛋白表达发酵，得到N‑脱氧核糖转移酶粗品；将脱氧核糖供体和碱基供体按比例称量后加入反应体系，加入N‑脱氧核糖转移酶粗品搅拌反应，得到2’‑脱氧腺苷酶催化反应液；对2’‑脱氧腺苷酶催化反应液加热，再离心除去不溶物，取上清液即得到含2’‑脱氧腺苷产品粗液；用碱性溶液对含2’‑脱氧腺苷产品粗液的pH值调整，放置于低温环境进行结晶，干燥处理，得到2’‑脱氧腺苷粗品；将预冷的碱水加入到2’‑脱氧腺苷粗品中，再在低温下搅拌洗杂，除去液体，得到固体物并干燥处理。节省原料，提高制备效率，降低制备成本。

技术领域

本发明属于重组酶催化工程和分离纯化技术领域，具体涉及一种利用酶催化制备2’-脱氧腺苷纯品的方法。

背景技术

2’-脱氧腺苷（2’-Deoxyadenosine，缩写dA），也称“2’-脱氧核糖腺嘌呤核苷”，是一种天然的脱氧核糖核苷，作为遗传物质脱氧核糖核酸（DNA）的有机组成成分，参与生物机体细胞的遗传信息的传递。2’-脱氧腺苷可作为基因药物和基因工程的原材料，并且还是许多抗病毒、抗肿瘤药物的重要中间体，比如用于抗逆转录酶病毒的药物地丹诺辛（2，3-双脱氧肌苷），以及用于慢性淋巴细胞白血病的治疗的氟达拉滨（阿糖腺苷的氟化核苷类似物）和治疗淋巴细胞增殖类疾病用的克拉屈滨（2-氯-2’-脱氧腺苷），在抗疱疹病毒药物中大多数也是核苷、脱氧核苷类似物。随着健康产业的发展，特别是经过2019年新冠状肺炎病毒的传播，对抗病毒药物的需求更加迫切，核苷类似物作为抗病毒药物的重要组成部分，需求量也在急剧增加。

2’-脱氧腺苷作为核苷类似物的中间体，其合成途径主要有化学合成法、生物发酵法以及酶工程合成法，化学合成法如专利CN 105884846 B（一种2’-脱氧腺苷的合成方法）所述，将腺苷采用二烷基氧化物作为酯化剂进行酯化，酰化剂和缚酸剂的酰化作用，得到酰化物，酰化物再经过还原和纯化处理，得到产物2’-脱氧腺苷，纯度在99%左右，但是整个化学合成依赖苛刻的反应条件，并且对环境容易造成污染；专利CN104178541B（一种利用大肠埃希氏菌转化生产2’-脱氧腺苷的方法）中使用核苷酸磷酸化酶来实现2’-脱氧腺苷的合成，但是其反应液需要缓冲盐，底物浓度只有3-5mmol，且需要3步结晶工艺，对于工业化放大生产有所限制。专利CN105754899B（一种N-脱氧核糖转移酶、编码基因及其高产菌株和应用） 提供希氏乳杆菌（Lactobacillus hilgardii）来源的N-脱氧核苷转移酶以2’-脱氧尿苷为核糖供体来合成2’-脱氧腺苷，但底物浓度仅为10mmol/L，产率仅为40-60%（见说明书第0057段），同样不足以满足工业化放大生产的期望要求。

基于上述已有技术，有必要加以合理探索与改进，下面将要介绍的技术方案便是在这种背景下产生的。

发明内容

本发明的任务在于提供一种利用酶催化制备2’-脱氧腺苷纯品的方法，该方法有助于避免对环境产生污染、有利于显著提高底物浓度并简化纯化工艺流程以及避免依赖繁琐的层析柱工艺、有益于节省原料及提高制备效率而得以满足产品的工业化放大生产要求。

本发明的任务是这样来完成的，一种利用酶催化制备2’-脱氧腺苷纯品的方法，包括以下步骤：

A) 制备N-脱氧核糖转移酶粗品，先将N-脱氧核糖转移酶重组大肠杆菌菌株接种至发酵培养基中，经诱导蛋白表达发酵，得到N-脱氧核糖转移酶粗品；

B) 制备2’-脱氧腺苷酶催化反应液，将脱氧核糖供体和碱基供体按比例称量后加入反应体系，加入纯化水搅拌混匀，调整反应液温度，加入由步骤A）得到的N-脱氧核糖转移酶粗品搅拌反应并且控制搅拌反应的时间，得到2’-脱氧腺苷酶催化反应液；

C) 制备含2’-脱氧腺苷产品粗液，先对由步骤B）得到的2’-脱氧腺苷酶催化反应液加热，再离心除去不溶物，取上清液即得到含2’-脱氧腺苷产品粗液；