[发明专利]一种具有抗疲劳作用的西藏凹乳芹多糖的制备方法及应用

权利要求书

1.一种具有抗疲劳作用的西藏凹乳芹多糖的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(一)西藏凹乳芹粗多糖的制备及初步纯化

(1)西藏凹乳芹粗多糖的制备：

取干燥的西藏凹乳芹，经粉碎后用10倍量的85％乙醇在室温下浸提3次，乙醇提取后的西藏凹乳芹，经过干燥后，按照料液比为1∶10加入蒸馏水，85℃加热提取3次，1h/次，在4500r/min条件下离心20min，收集上清液，60℃减压浓缩至浸膏，在搅拌条件下，将浸膏加入10倍浸膏重量体积的95％乙醇中，室温静置48h，在10000r/min条件下离心10min，沉淀用水溶解，浓缩，冷冻干燥得西藏凹乳芹粗多糖；

(2)西藏凹乳芹多糖的纯化：

多糖纯度直接影响到多糖质量和作用效果，因此对西藏凹乳芹多糖进一步纯化，具体过程如下：

a、采用D101型大孔吸附树脂对以上粗多糖进行脱色，将大孔吸附树脂用95％的乙醇浸泡24h后，倒入10cm×90cm的层析柱，用蒸馏水洗脱平衡12h，将粗多糖溶于水，上样后吸附过夜，用蒸馏水洗脱，减压浓缩洗脱液，冷冻干燥后，得到脱色后的粗多糖；

b、脱蛋白：取脱色后的粗多糖，溶于蒸馏水中，置于分液漏斗，加入糖液的1/2体积试剂配比为三氯甲烷∶正丁醇＝5∶1的Sevag试剂，然后剧烈震荡5min后，静置分层，3000r/min条件下离心，收集上清液，重复操作至无变性蛋白层出现，减压浓缩，加入10倍量95％乙醇，4℃静置过夜，离心，冷冻干燥，得脱蛋白的西藏凹乳芹多糖，命名为VTP(Vicatiathibertica de Boiss Polysaccharide，VTP)；

c、蛋白去除率的计算：蛋白去除率＝(去除蛋白前蛋白的含量-去除蛋白后蛋白的含量)/去除蛋白前蛋白的含量*100％；

(二)对上述西藏凹乳芹多糖含量进行测定

(1)试剂配制

a、苯酚溶液配制：取精制的苯酚加蒸馏水，配制成6％苯酚溶液，备用；

b、标准溶液配制：精密称取0.5000g葡萄糖，于100mL容量瓶中定容，从中取出1mL溶液加水定容到50mL，得到100μg/mL的标准溶液；

(2)标准曲线的制作

用微量移液器分别取100μg/mL的标准溶液0.5mL、1mL、1.5mL、2mL、2.5mL、3mL定容于50mL的容量瓶中，分别取1mL于试管中，各加入6％苯酚1mL，浓硫酸5mL，摇晃试管，混合，静置，用722型分紫外光度计于490nm处测吸光度值，求算回归方程；

(3)西藏凹乳芹多糖中总糖含量测定

将检测样品配成200μg/mL溶液，然后取样1mL，其他步骤和标准曲线制作一致，检测结束后，计算西藏凹乳芹多糖总糖含量；

(4)3，5-二硝基水杨酸法测所制备西藏凹乳芹多糖中还原糖的含量：

试剂的配置：

a、间羟基联苯的配制：称取间羟基联苯用5mg/mL NaOH溶液配成质量浓度为1.5mg/mL，4℃避光保存；

b、四硼酸钠硫酸溶液配制：取四硼酸钠用浓硫酸配成0.125mol/L，室温保存；

c、葡萄糖醛酸标准溶液的配制：准确称取0.5000g葡萄糖醛酸，用蒸馏水配成100μg/mL的标准溶液；

葡萄糖醛酸标准曲线的制作：

用微量移液器分别取100μg/mL的标准溶液0mL、0.1mL、0.2mL、0.3mL、0.4mL、0.5mL到试管中，加蒸馏水补到1mL，冰浴，加四硼酸钠硫酸溶液5mL，沸水浴，加间羟基联苯溶液100μL，37℃恒温水浴10min，用722型分光光度计于525nm处测吸光度值，求算回归方程，

多糖糖醛酸含量测定：

将检测样品配制成为200μg/mL溶液后，取1mL于试管中，其他步骤和标准曲线制作一致，测量完毕后，计算西藏凹乳芹糖醛酸含量，

多糖得率计算公式：

西藏凹乳芹多糖得率Y(％)＝(WE×(CT-CR))/WP×100

WE为纯化后多糖的重量，WP为每次实验中使用的西藏凹乳芹预处理样品重量，CT和CR分别为纯化后多糖中总糖及还原糖的含量；

(三)对西藏凹乳芹多糖进一步分离纯化

(1)采用DEAE-琼脂糖凝胶FF柱色谱进一步分离纯化，将一定量的DEAE-琼脂糖凝胶FF倒入到2.6cm×20cm的层析柱中，用蒸馏水持续洗涤DEAE柱至pH值为7.0，并用玻璃棒搅拌凝胶排除空气，将西藏凹乳芹多糖配成20mg/mL溶液，上样，自动接样器接样，用去离子水和0.1、0.2、0.3mol/L氯化钠洗脱，用苯酚-硫酸法在490nm跟踪检测西藏凹乳芹多糖吸光度值，绘制洗脱分布曲线图，分段收集，合并洗脱液，透析，浓缩，冷冻干燥48h，得到白色有光泽的4种西藏凹乳芹均一多糖，根据西藏凹乳芹的拉丁名命名为：VTP1、VTP2、VTP3和VTP4分别对应“去离子水”和0.1、0.2、0.3mol/L氯化钠洗脱的成分，在所述多糖中的质量百分比分别为90.03％、3.82％、0.78％、0.21％；

(2)取一定量的葡聚糖凝胶G-100加水溶胀后，100℃煮沸1h，冷却至室温，倒入到固定好的2.6cm×20cm的层析柱中，接上自动接样器，用蒸馏水洗脱平衡24h，将VTP1和VTP2用水溶解，上样，水洗脱，用苯酚-硫酸法于490nm跟踪检测西藏凹乳芹多糖的吸光度值，绘制洗脱分布曲线图，分段收集，合并洗脱液，冷冻干燥，得到更纯的均一多糖，VTP1的平均分子量为1.53×10⁶Da，VTP2的平均分子量为1.45×10⁶Da。