[发明专利]一种高纯度胰激肽原酶的分离纯化方法

权利要求书

1.一种高纯度胰激肽原酶的分离纯化方法，其特征在于：包括以下步骤：

a.从猪胰中提取粗胰酶，向600-700份水中加入1-2份冰醋酸，再向醋酸溶液中加入20-30份粗胰酶和20-30份聚乙二醇，在10-20℃条件下静置12-16h；

b.板框压滤步骤a中静置后的混合液，板框压滤后获得清液；

c.将步骤b中获得的清液上样至平衡处理后的阴离子交换层析柱，采用pH 5.1 0.5M的乙酸钠进行洗脱；

d.向步骤c中获得的洗脱液中加入等体积的反胶束溶液，漩涡混合1-5min，静置分相；

e.取萃取分相后的有机相，加入等体积的反萃取水相，漩涡混合1-5min，静置分相；

f.取步骤e中分相后的水相，加入0.01-0.1份稳定剂，冷冻干燥制得高纯度胰激肽原酶；

步骤d中，所述反胶束溶液的配置方法为取十六烷基三甲基溴化铵溶于有机溶剂中，配置成10-20mmol/L的溶液，所述有机溶剂为正己烷和正丁醇的混合液，正己烷和正丁醇的体积比为4-5:1；

步骤e中，所述反萃取水相为含有1.0-2.0mol/L KBr和10-25%异丙醇的混合液。

2.根据权利要求1所述的一种高纯度胰激肽原酶的分离纯化方法，其特征在于：步骤a中，粗胰酶的制备方法包括以下步骤：

Ⅰ.在0-4℃条件下，将新鲜猪胰或冷冻猪胰脏进行搅碎并研磨成浆状；

Ⅱ.向胰浆中加入激活剂和保护剂，搅拌均匀，置于0-4℃放置6-12h；

Ⅲ.加入胰脏重量1-2倍的预冷的25%乙醇，置于15-25℃搅拌1-3h，过滤；

Ⅳ.向步骤Ⅲ中获得的滤饼中加入胰脏重量1-2倍的预冷的25%乙醇，置于15-25℃搅拌1-3h，过滤；

Ⅴ.合并步骤Ⅲ和Ⅳ中获得的滤液，向合并后的滤液中加入壳聚糖，搅拌10-20min，0-4℃条件下3000-5000r/min离心3-8min，收集沉淀；

Ⅵ.向沉淀中加入胰脏重量1-2倍的预冷的丙酮，再次收集沉淀，得到粗胰酶。

3.根据权利要求2所述的一种高纯度胰激肽原酶的分离纯化方法，其特征在于：步骤Ⅱ中，所述激活剂为CaCl₂和猪的十二指肠中的一种或两种；所述激活剂的加入量为胰浆质量的0.2%-0.5%。

4.根据权利要求2所述的一种高纯度胰激肽原酶的分离纯化方法，其特征在于：步骤Ⅱ中，所述保护剂为乳糖、蔗糖和马铃薯淀粉中的一种或几种；所述保护剂的加入量为胰浆质量的0.2%-0.5%。

5.根据权利要求2所述的一种高纯度胰激肽原酶的分离纯化方法，其特征在于：步骤Ⅴ中壳聚糖的加入量为胰浆质量的0.1-0.3%。

6.根据权利要求1所述的一种高纯度胰激肽原酶的分离纯化方法，其特征在于：步骤c中，阴离子交换层析柱采用pH 5.1 0.02M的乙酸钠进行平衡，阴离子介质为QAE-Sephadex阴离子介质。

7.根据权利要求1所述的一种高纯度胰激肽原酶的分离纯化方法，其特征在于：步骤f中，所述稳定剂为海藻糖和透明质酸中的一种或两种。