[发明专利]一种高纯度胰激肽原酶的分离纯化方法

说明书

本申请公开了一种高纯度胰激肽原酶的分离纯化方法，属于酶分离纯化技术领域。分离纯化方法为：从猪胰中提取粗胰酶，向600‑700份水中加入1‑2份冰醋酸，再加入20‑30份粗胰酶和20‑30份聚乙二醇，在10‑20℃条件下静置12‑16h；板框压滤静置后的混合液获得清液；将清液上样至阴离子交换层析柱，采用pH 5.1 0.5M的乙酸钠洗脱；将洗脱液与等体积的反胶束溶液混合，静置分相；取分相后的有机相加入等体积的反萃取水相，漩涡混合，静置分相；取分相后的水相加入稳定剂冷冻干燥制得高纯度胰激肽原酶。本申请获得的胰激肽原酶具有较高的酶活力和纯度，且分离纯化方法操作简单，原料成本低廉，特别适合工业大生产。

技术领域

本申请涉及酶分离纯化技术领域，特别涉及一种高纯度胰激肽原酶的分离纯化方法。

背景技术

胰激肽原酶也称胰激肽释放酶，是丝氨酸蛋白酶家族的一员,但和典型丝氨酸蛋白酶不同的是其专一性较强,对酪蛋白、血红蛋白等常见蛋白质底物几乎不起作用,而专一的作用于蛋白质底物激肽原而释出激肽。

激肽释放酶分为血浆激肽释放酶和组织激肽释放酶。组织激肽释放酶是一种单链的酸性糖蛋白,平均分子量范围是25-45KD，等电点为4.05。组织激肽释放酶最初的形式是激肽释放酶原,它以激肽释放酶原的形式在组织中合成,然后被释放到组织液中,经过胰蛋白酶、内毒素激活就形成了活性的激肽释放酶。激活的组织激肽释放酶作用于低分子量的组织激肽原,生成活性产物胰激肽,也称血管舒缓素或赖氨酸缓激肽,后者可以进入组织毛细血管,经过毛细血管中的氨基肽酶水解去掉赖氨酸后就形成了活性更强的缓激肽从而发挥作用。所以，组织激肽释放酶可以使毛细血管和动脉血管舒张以及通透性增加,使冠状动脉、脑、视网膜处的血流供应增加,适用于高血压冠状血管以及动脉血管硬化等症,对心绞痛、血管痉挛、血栓性闭塞性脉管炎、冻疮以及创伤等症也有作用。同时，激肽释放酶通过与其它血管活性物质相互作用,参与肾脏功能调节,降低血压,促进电解质和葡萄糖的转运。激肽释放酶也可以作为活化因子,使纤溶酶原激活成纤溶酶,将不溶性的纤维蛋白水解成可溶性的小肽,从而对脑梗塞、动脉粥样硬化等起到治疗作用,并用于治疗血栓、预防血栓再形成。

目前临床用药主要是从组织中提取激肽释放酶，组织激肽释放酶以猪胰激肽释放酶为主。猪胰激肽释放酶纯化技术研究已有近30年的历史，主要以猪胰脏的丙酮粉或胰酶为原料提取激肽释放酶。纯化方法主要有有机溶剂分级沉淀法、离子交换层析法和亲和层析法。有机溶剂沉淀法对酶蛋白有破坏作用,所得产品比活较低。而亲和层析法虽然可以制备高纯度的激肽释放酶,但操作容积小,成本较高不适用于工业化生产。离子交换法虽然能够制备活性较高的酶蛋白且符合工业化生产，但是不论采用哪种介质,想要制备高纯度的激肽释放酶需要经过多次的层析，操作繁琐, 步骤繁多，胰脏资源的利用率低，导致生产成本增高。

发明内容

针对现有技术存在的不足，本申请的目的是提供一种高纯度胰激肽原酶的分离纯化方法，以获得一条工艺简单、成本低、提取效率高的胰激肽原酶纯化路线，使用该纯化方法可以获得符合药品质量标准的高纯度胰激肽原酶。

本申请的上述技术目的是通过以下技术方案得以实现的：

一种高纯度胰激肽原酶的分离纯化方法，包括以下步骤：

a. 从猪胰中提取粗胰酶，向600-700份水中加入1-2份冰醋酸，再向醋酸溶液中加入20-30份粗胰酶和20-30份聚乙二醇，在10-20℃条件下静置12-16h；

b.板框压滤步骤a中静置后的混合液，板框压滤后获得清液；

c.将步骤b中获得的清液上样至平衡处理后的阴离子交换层析柱，采用pH 5.10.5M的乙酸钠进行洗脱；

d.将步骤c中获得的洗脱液与等体积的反胶束溶液混合，漩涡混合1-5min，静置分相；

e.取萃取分相后的有机相，加入等体积的反萃取水相，漩涡混合1-5min，静置分相；