[发明专利]栽培花生AhGPAT9B基因的克隆方法

权利要求书

1.一种用于克隆栽培花生AhGPAT9B基因的引物组合，其特征在于，所述引物组合包括：

引物对BG01，其序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示；

引物对BG02，其序列分别如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示；

引物对BG03，其序列分别如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示；

引物对BG04，其序列分别如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示；

引物对BG05，其序列分别如SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示；

引物对BG06，其序列分别如SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12所示；和，

引物对BG07，其序列分别如SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14所示。

2.权利要求1所述的引物组合在从栽培花生中克隆获得B染色体组AhGPAT9B基因中的应用。

3.一种栽培花生AhGPAT9B基因的克隆方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)以从花生叶片中提取的基因组DNA为模板，利用权利要求1所述的引物组合进行PCR扩增，得到7段PCR扩增产物；

(2)将步骤(1)得到的7段PCR扩增产物分别与克隆载体连接，筛选阳性克隆，将阳性克隆进行扩大培养，并进行测序；

(3)将测序正确的7个片段进行拼接，得到完整的包含5’和3’末端的AhGPAT9B全长DNA序列。

4.根据权利要求3所述的克隆方法，其特征在于，步骤(1)中，PCR扩增的体系为20μL，包括：模板DNA 2μL，10μM的上/下游引物各0.5μL，10×PCR bufferⅡ2μL，2.5mM dNTPs 1.6μL，TransStart Taq 0.2μL，ddH₂O 13.2μL。

5.根据权利要求3所述的克隆方法，其特征在于，步骤(1)中，PCR扩增的条件为：94℃预变性5min；94℃变性30s，(50-59℃)退火45s，72℃延伸1.5min，35个循环；72℃后延伸10min。

6.根据权利要求3所述的克隆方法，其特征在于，步骤(2)中，PCR扩增产物与克隆载体连接的方法为：将4μL PCR扩增产物和1μL克隆载体混合，25℃反应20min。

7.根据权利要求3所述的克隆方法，其特征在于，步骤(3)中，所述拼接具体为：将测序正确DNA片段在DNAMAN软件中依次进行比对分析，利用相邻扩增片段间的重叠部分进行序列拼接，获得完整AhGPAT9B基因全长序列。