[发明专利]一种重组多形汉逊酵母的构建方法及其应用

说明书

本申请提供了一种重组多形汉逊酵母菌株的构建方法及其应用，方法包括构建靶向核苷酸序列的sgRNA表达载体；将表达载体导入多形汉逊酵母菌株，敲除菌株中的OpFAA1基因。本申请还提供了一种脂肪醇合成重组汉逊酵母菌株的构建方法。构建的重组多形汉逊酵母菌株在多种碳源条件下均能够有效地积累脂肪酸。在此基础上通过增加细胞内NADPH供给，进一步提高单位生物量脂肪酸产量。同时，过表达MmCAR、npgA、ADH5、FaCoAR，并敲除基因OPFAA1或/和OpHFD1，首次在多形汉逊酵母中实现脂肪醇合成。进一步地，在高产脂肪酸菌株中游离表达JeOleT实现了α‑烯烃的合成，拓展了其在细胞工厂应用的应用潜力。

技术领域

本发明属于微生物基因工程与代谢工程应用领域，具体涉及一种产脂肪酸、脂肪醇和α-烯烃的重组多形汉逊酵母的构建方法、优化及其应用。

背景技术

脂肪酸及其衍生物(脂肪醇、脂肪酸烷基酯和烷烃等)在能源、医药和化妆品等领域具有广泛应用潜力。由脂肪酸衍生的生物燃料和油脂化合物，由于其更高的能量密度、与现有燃料更加相似的储藏运输特性和燃烧性能等，使其逐渐成为目前汽油、柴油和航空燃料最主要的替代产品。游离脂肪酸还广泛用于生产肥皂、表面活性剂和润滑油等化工产品。除此之外，脂肪醇是目前去污剂、护肤品等化妆品和医药领域的主要生产原材料。2016年，脂肪醇全球市场超过了37亿美元，并且还在持续增长。但是，随着脂肪酸及其衍生物市场需求量不断增大，从天然动植物提取脂肪酸及其衍生物势必会对动植物生存、生物多样性以及生态效应造成不可逆转的影响。因此，目前急需一种更加高效的和环境友好的脂肪酸及其衍生物的生产模式。

以微生物作为细胞工厂制造脂肪酸及其衍生物是对传统化学合成方法的有效补充，正日益成为工业生物技术领域不可或缺的组成部分。近年来，以模式微生物作为宿主构建的脂肪酸以及衍生物生产菌株取得了重要进展。以大肠杆菌为宿主，通过多基因优化实现了批式补料发酵脂肪酸产量8.6g/L(Xu et al.Nat.Comm.,2013,4:1409.)；以酿酒酵母为宿主，通过全面的代谢途径改造以及优化关键基因的来源及表达强度，实现摇瓶水平脂肪酸产量超过1g/L，批式补料达到了10.4g/L(Zhou et al.Nat.Comm.,2016,7:11709.)。同时，Feng等认为脂肪醇的积累可能与细胞内的磷脂代谢相关，并通过敲除相关基因首次将酵母脂肪醇产量提高到330mg/L，批式补料下达到1.1g/L(Feng et al.Metab.Eng.,2015,27:10-19.)。最近，Jay D.Keasling等通过整合多种合成生物学策略，成功将酵母脂肪醇摇瓶发酵产量提高到1g/L以上，并在批式补料条件下达到6g/L，基本与脂肪酸产量相当，推进了酵母脂肪醇的工业化生产(d’Espaux L et al.Metab.Eng.,2017,42:115-125.)。

但是，目前脂肪酸及其衍生物的生产原料还主要以葡萄糖为主。但是，传统的生物质或者粮食原料受到耕地面积、地理气候等因素制约。甲醇是重要的一碳化合物，由于其低廉的价格和稳定的供应，有望成为继生物质糖类外另一重要原料。而且，甲醇的生物转化将促进我国煤炭资源洁净利用，实现重要能源产品和精细化学品的高效生产，并最终推动我国生产模式转型。

多形汉逊酵母是一种重要的甲基营养型酵母，具有广泛的底物谱，能够天然利用木糖和甲醇等碳源，而且能够耐受50℃以上高温，这些优良特性使其成为一种潜在的优良微生物细胞工厂。但是，目前以汉逊酵母为底盘细胞生产脂肪酸及其衍生物的领域还是一片空白。因此，本发明旨在构建汉逊酵母脂肪酸以及衍生物的高产菌株，一方面填补领域空白，另一方面探索汉逊酵母作为细胞工厂的应用潜力与前景。

发明内容

本发明的目的是提供一种产脂肪酸、脂肪醇和α-烯烃的重组多形汉逊酵母的构建方法、优化及其应用。

本发明的第一方面，提供一种产脂肪酸的重组多形汉逊酵母菌株的构建方法，能够显著增加脂肪酸的积累量，脂肪酸积累量在1500mg/L以上。