[发明专利]抑制OsHIS1基因表达的植物连锁表达载体及其构建方法和应用

权利要求书

1.一种抑制OsHIS1基因表达的植物连锁表达载体，其特征在于，其包括抑制OsHIS1基因表达的元件、育性恢复基因元件、花粉致死基因元件和荧光标记基因元件。

2.根据权利要求1所述的植物连锁表达载体，其特征在于，所述抑制OsHIS1基因表达的元件包括CRISPRi沉默元件或RNAi沉默元件。

3.根据权利要求2所述的植物连锁表达载体，其特征在于，所述CRISPRi沉默元件由所述植物除草剂抗性基因的CIRSPRi靶点双链通过酶切连接反应连入载体pHdzCas9-KRAB后得到，所述植物除草剂抗性基因的CIRSPRi靶点双链的核苷酸序列如SEQ ID NO.11和SEQID NO.12所示。

4.根据权利要求2所述的植物连锁表达载体，其特征在于，所述RNAi沉默元件由植物除草剂抗性基因的CDS序列和其反向互补序列以及Linker序列通过酶切连接反应一起连入载体pEGRNAi后得到，所述CDS序列和其反向互补序列之间由Linker序列隔开；所述CDS序列如SEQ ID NO.3所示，所述反向互补序列如SEQ ID NO.4所示，所述Linker序列如SEQ ID NO.5所示。

5.根据权利要求1-4中任一项所述的植物连锁表达载体，其特征在于，所述花粉致死基因元件包括如SEQ ID NO.7所示的Pg47启动子序列、如SEQ ID NO.1所示的ZMAA1基因cDNA序列和如SEQ ID NO.8所示的IN2-1终止子序列；所述荧光标记基因元件包括如SEQ IDNO.9所示的1tp启动子序列、如SEQ ID NO.2所示的DsRed基因cDNA序列和如SEQ ID NO.10所示的PINII终止子序列；所述育性恢复基因元件包括EAT1基因、PTC1基因、TDR基因、CYP704B2基因或PTB1基因，其中，所述EAT1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示，所述PTC1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示，所述TDR基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示，所述CYP704B2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示，所述PTB1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.16所示。

6.一种如权利要求1-5中任一项所述植物连锁表达载体的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：首先，构建抑制OsHIS1基因表达的元件，然后将所述抑制OsHIS1基因表达的元件通过重组反应连入至少含有育性恢复基因元件、花粉致死基因元件、荧光标记基因元件的植物三元连锁表达载体中，即得到所述植物连锁表达载体。

7.根据权利要求6所述的构建方法，其特征在于，所述抑制OsHIS1基因表达的元件包括CRISPRi沉默元件或RNAi沉默元件；

所述RNAi沉默元件的构建方法包括如下步骤：首先，分别扩增水稻OsHIS1中CDS序列和其反向互补序列以及Linker序列，然后将扩增产物通过酶切连接反应一起连入载体pEGRNAi中，所述CDS序列和其反向互补序列之间由Linker序列隔开，即得到所述RNAi沉默元件；

所述CRISPRi沉默元件的构建方法包括如下步骤：首先，将如SEQ ID NO.11和SEQ IDNO.12所示的两条核苷酸单链等量混合，经过变性、退火后形成具有粘性末端的CIRSPRi靶点双链，然后将所述CIRSPRi靶点双链用Bsa1酶通过酶切连接反应连入载体pHdzCas9-KRAB中，即得到所述CRISPRi沉默元件。

8.根据权利要求7所述的构建方法，其特征在于，所述RNAi沉默元件的构建方法中，扩增所述CDS序列的正反引物分别如SEQ ID NO.17和SEQ ID NO.18所示，扩增所述反向互补序列的正反引物分别如SEQ ID NO.19和SEQ ID NO.20所示，扩增所述Linker序列的正反引物分别如SEQ ID NO.21和SEQ ID NO.22所示。