[发明专利]抑制OsHIS1基因表达的植物连锁表达载体及其构建方法和应用

说明书

本发明公开了一种抑制OsHIS1基因表达的植物连锁表达载体，其包括抑制OsHIS1基因表达的元件、育性恢复基因元件、花粉致死基因元件和荧光标记基因元件。还公开了该植物连锁表达载体的构建方法，其得到的植物连锁表达载体转化不育系后，可以通过β三酮类除草剂杀死色选漏检的含有转基因成分的繁殖系，转基因效果精准，除杂效率高。本发明还公开了该植物连锁表达载体在第三代杂交水稻制种或机械化混播混收制种中的应用，可以有效规避第三代杂交水稻制种或机械化混播混收制种使用不育系因色选漏检带来的杂交制种及获得的杂交种子转基因污染风险，操作简单、高效。

技术领域

本发明属于杂交水稻育种技术领域，尤其涉及一种抑制OsHIS1基因表达的植物连锁表达载体及其构建方法和应用。

背景技术

我国水稻杂种优势利用技术的发展经历了三个时代。第一代杂交水稻是以细胞质(核质互作)雄性不育系为遗传工具的三系法杂交水稻，三系不育系育性稳定，但杂交配组受恢保关系局限。第二代杂交水稻是以光温敏核不育系为遗传工具的两系法杂交水稻，克服了父母本组配不自由的问题；但因不育系育性受外界光温条件影响存在制种失败的风险。第三代杂交水稻以普通核不育系(即遗传工程核不育系)作为遗传工具利用杂种优势，克服了第一代、第二代技术存在的技术瓶颈，兼具有不育系育性稳定、配组自由双重优点，是杂交水稻技术发展方向。

遗传工程核不育系的繁殖和分选是第三代杂交水稻的核心技术，现已实现了遗传工程不育系种子的批量繁殖和胚乳荧光分选技术(参见专利CN201210426678.7)。为了使不育系色选过程中万无一失的筛除含有转基因成分的繁殖系，也有相关专利在原有胚乳荧光标记的基础上引入了颖壳颜色这一双重保险，通过两次色选进一步提高不育系的纯度(参见专利CN201910699895.5，CN201910699890.2)。然而在实际色选过程中，由于色选机器存在一定的色选误差，这种方法仍然会在不育系中掺杂进含有转基因的繁殖系，这对不育系进一步杂交制种带来了转基因污染的风险。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是，克服以上背景技术中提到的不足和缺陷，提供一种抑制OsHIS1基因表达的植物连锁表达载体及其构建方法和应用，通过构建抑制OsHIS1基因表达以及其他功能基因结合的植物连锁表达载体，结合色选技术和除草剂，可以提高第三代杂交水稻不育系及其杂交种子的纯度。

为解决上述技术问题，本发明提出的技术方案为：

一种抑制OsHIS1基因表达的植物连锁表达载体，其包括抑制OsHIS1基因表达的元件、育性恢复基因元件、花粉致死基因元件和荧光标记基因元件。

上述的连锁表达载体，优选的，所述抑制OsHIS1基因表达的元件包括CRISPRi沉默元件或RNAi沉默元件。CRISPRi(聚类的规则间隔的短回文重复序列干扰)是利用无活性的dCas9蛋白和可定制的单个向导RNA(sgRNA)共表达，dCas9与转录阻遏物结构域的偶联可以强有力地沉默多个目标内源基因的表达。

更优选的，所述CRISPRi沉默元件由所述植物除草剂抗性基因的CIRSPRi靶点双链通过酶切连接反应连入载体pHdzCas9-KRAB后得到，所述植物除草剂抗性基因的CIRSPRi靶点双链的核苷酸序列如SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12所示。

更优选的所述RNAi沉默元件由植物除草剂抗性基因的CDS序列和其反向互补序列以及Linker序列通过酶切连接反应一起连入载体pEGRNAi后得到，所述CDS序列和其反向互补序列之间由Linker序列隔开；所述CDS序列如SEQ ID NO.3所示，所述反向互补序列如SEQID NO.4所示，所述Linker序列如SEQ ID NO.5所示。