[发明专利]多形汉逊酵母基因编辑系统、其应用以及基因编辑方法

权利要求书

1.一种多形汉逊酵母CRISPR/Cas9基因编辑系统，其特征在于，所述多形汉逊酵母CRISPR/Cas9基因编辑系统包含以下组件：

（1）Cas9蛋白，所述Cas9蛋白整合于多形汉逊酵母基因组中；

（2）sgRNA表达载体；

所述sgRNA表达载体包括sgRNA的表达盒；

其中，sgRNA表达盒由RNA pol II型启动子和终止子以及相应的核酶识别序列HH和HDV组成；

所述RNA pol II型启动子为pTEF1。

2.根据权利要求1所述的多形汉逊酵母CRISPR/Cas9基因编辑系统，其特征在于，所述sgRNA表达载体含有来源于乳酸克鲁维酵母的自主复制起始序列panARS。

3.根据权利要求1所述的多形汉逊酵母CRISPR/Cas9基因编辑系统，其特征在于，所述sgRNA表达载体含有来源于汉逊酵母自身的URA3基因作为抗性基因和反向筛选标记。

4.根据权利要求1所述的多形汉逊酵母CRISPR/Cas9基因编辑系统，其特征在于，所述sgRNA表达载体使用固定的N6序列。

5.根据权利要求1所述的多形汉逊酵母CRISPR/Cas9基因编辑系统，其特征在于，所述CRISPR/Cas9基因编辑系统包括来源于酵母的单独或组合过表达的同源重组相关蛋白Rad51、Rad52和Sae2。

6.根据权利要求5所述的多形汉逊酵母CRISPR/Cas9基因编辑系统，其特征在于，所述酵母选自酿酒酵母和汉逊酵母。

7.根据权利要求1所述的多形汉逊酵母CRISPR/Cas9基因编辑系统，其特征在于，在所述多形汉逊酵母CRISPR/Cas9基因编辑系统中，基因KU80启动子以原位替换的方式替换为pHpMET3，以降低汉逊酵母非同源末端链接强度。

8.一种基因编辑方法，其特征在于，所述方法采用根据权利要求1至7中任一项所述的多形汉逊酵母CRISPR/Cas9基因编辑系统，并包括以下步骤：

（1）以所述sgRNA表达载体出发，构建靶向于目标供体的sgRNA表达载体；

（2）以重叠延伸PCR的方法构建基因敲除和表达的供体DNA片段，同源臂长度为200 bp~1000 bp；

（3）将sgRNA表达载体和供体DNA分子导入汉逊酵母细胞。

9.根据权利要求8所述的基因编辑方法，其特征在于，在步骤（3）之后，还包括以下步骤：

（4）验证正确的转化子置于含有5-氟乳清酸的培养基中培养，进行质粒丢失，质粒丢失后的重组汉逊酵母进行下一轮基因组编辑。

10.根据权利要求1至7中任一项所述的多形汉逊酵母CRISPR/Cas9基因编辑系统或根据权利要求8或9所述的基因编辑方法在基因无缝敲除、定点整合、体内载体多片段自组装或体内多片段定点组装中的至少一种中的应用。

11.根据权利要求10所述的应用，其特征在于，在所述基因无缝敲除中，同源臂长度为200~1000 bp；

在所述定点整合中，片段长度为5.5 kb，同源臂长度为1000 bp；

在所述体内载体多片段自组装中，载体长度为20 kb，片段数量为3~5段；

在所述体内多片段定点组装中，片段全长为7.4 kb~15.2 kb，片段的数量为1~4段。

12.根据权利要求11所述的应用，其特征在于，在所述基因无缝敲除中，同源臂长度为500~1000 bp，位于启动子或终止子区域。