[发明专利]多形汉逊酵母基因编辑系统、其应用以及基因编辑方法

说明书

本申请公开了一种多形汉逊酵母CRISPR/Cas9基因编辑系统，所述系统包含以下组件：(1)Cas9蛋白，所述Cas9蛋白整合于多形汉逊酵母基因组中和(2)sgRNA表达载体；sgRNA表达载体包括sgRNA表达盒；其中，sgRNA表达盒由RNA pol II型启动子和终止子以及相应的核酶识别序列HH和HDV组成。本发明的基因编辑系统具有极高的基因组编辑效率和较高的同源整合能力，由此进一步拓展了汉逊酵母作为细胞工厂的应用潜力，使其在遗传改造过程中更加简洁、快速、方便和精准。

技术领域

本发明属于微生物基因工程应用领域，具体涉及一种多形汉逊酵母基因编辑系统及其应用。

背景技术

自然界中，存在一类“甲基营养型”微生物，能够利用C1化合物(甲烷、甲醇等)为碳源进行生长代谢，它们主要包括一些原核细菌以及甲醇酵母。其中，多形汉逊酵母是一种重要的甲基营养型酵母，具有广泛的底物谱，能够天然利用木糖和甲醇等碳源，而且能够耐受50℃以上高温，这些优良特性使其成为一种潜在的优良微生物细胞工厂。举例来说，汉逊酵母能够天然利用木糖和耐高温的特性，使其长期以来一直作为蛋白表达以及纤维素乙醇发酵的优良宿主。汉逊酵母作为一种非传统酵母，尽管具有诸多优良特性，但其基因操作难度较大，缺少稳定的表达载体，同源整合效率低等。这都将影响后续对其甲醇代谢过程的改造和强化。

近年来，CRISPR-Cas9系统被广泛应用于真核、原核、模式以及非模式等众多生物体系，并以其较高的编辑效率和精准性正逐步成为目前基因组编辑的常规工具。CRISPR-Cas9系统行使基因编辑功能依赖Cas9蛋白和导向RNA(sgRNA)。Cas9蛋白是一种RNA介导的核酸内切酶，其上的两个活性位点，HNH功能域和RuvC功能域，能够断裂双链DNA分子。而Cas9蛋白发挥功能需要核定位信号(NLS)和sgRNA。作为CRISPR系统的另一关键组件，sgRNA由靶向RNA(crRNA)和反向激活RNA(tracrRNA)组成。20bp的crRNA来源于靶向序列，且其3’端含有标志性的PAM序列(NGG)。sgRNA形成特定的二级结构并引导Cas9蛋白靶向特定序列完成双链DNA断裂。一旦断裂形成，细胞就会启动DNA修复机制，通过非同源末端链接和同源重组等机制完成断裂修复。非同源末端链接修复的DNA会发生碱基的缺失或突变导致基因失活，而同源重组修复的DNA会引入特定模板序列。

CRISPR-Cas9系统已经成功应用于汉逊酵母，实现了基因的定点敲除和同源整合。首先，Numamoto等使用pHpTDH3启动Cas9蛋白表达，sgRNA的启动子来源于汉逊酵母自身的tRNA^CUG。当靶向基因HpADE12、HpPHO1、HpPHO11和HpPHO84时，基因突变效率达到17～71％(Numamoto et al.J.Biosci.Bioeng.,2017,124(5):487-492.)；其次，Juergens等利用含有复制起始位点(panARS)的游离质粒来表达Cas9蛋白和sgRNA。以来源于Arxulaadeninivorans的pTEF1和ScPHO5基因的终止子构建SpCas9^D147Y,P411T表达盒。同时，为了确保sgRNA的有效表达，他们选用II型启动子(pScTDH3)，并在sgRNA序列两端引入核酶识别位点。但是，最终靶向HpADE2基因的突变效率只有9％左右(Juergens et al.FEMS YeastRes.,2018,18(3):foy012.)；最后，通过将Cas9蛋白和sgRNA表达组件整合至rDNA位点，Wang等成功实现50％以上的基因敲除效率，且能够成功实现单基因以及多基因的同源重组过程，取得了目前为止汉逊酵母中最好的基因组编辑效果(Wang etal.Biotechnol.Biofuels,2018,11(1):277.)。

尽管目前能够利用CRISPR-Cas9系统实现基因组的编辑过程，但是效率相对较低，特别是同源重组效率远远达不到成为细胞工厂宿主菌的要求。

发明内容