[发明专利]鸭腺病毒Ⅰ型Penton蛋白及其制备方法和应用

说明书

本发明属于蛋白质工程领域，特别是指一种鸭腺病毒Ⅰ型Penton蛋白及其制备方法和应用。发明人分析发现Penton蛋白呈亲水性，无跨膜结构域，无信号肽预测等优势选择进行全长表达。Penton目的片段通过序列优化后经人工合成方式获取，蛋白的表达方式为无细胞蛋白表达。与传统Penton蛋白抗原优势表位截短表达相比较，人工合成并表达后的Penton重组蛋白准确率高，既保证了蛋白的中和性，又避免了高突变率的困扰，更利于运用在抗体检测技术的开发。另外该表达体系具有独特的优势,包括节约时间、提高可溶的、全长蛋白的总体产量。除此之外，该表达体系成本低，表达量大，Western Blot检测反应原性强。

技术领域

本发明属于蛋白质工程领域，特别是指一种鸭腺病毒Ⅰ型Penton蛋白及其制备方法和应用。

背景技术

鸭腺病毒Ⅰ型病毒（Duck adenovirus type 1,DAV1）是包括产蛋下降综合症病毒(Egg drop syndrome virus，EDSV)或类似EDSV 的一类腺病毒，为腺病毒科胸腺病毒属(Atadenovirus)的成员。其代表病毒为是产蛋下降综合征（EDSV）,该病使产蛋鸡或种母鸡产蛋率下降的病毒性传染病。产蛋鸡感染EDS病毒后，鸡群产蛋量无法达到高峰期或产蛋量大幅下降，可使产蛋量下降20％～30％，严重影响到蛋鸡产业的发展，给广大养殖户及养殖企业带来巨大的经济损失，危害性非常严重。

目前DAV1在全世界范围内均存在分布，给许多国家的养禽业带来了严重的经济损失，ELLSA检测抗体时具有简便、快捷、敏感、特异等优点，在生产领域得到广泛的应用，但目前的试剂盒主要以全病毒作为包被抗原，纯化病毒粒子的过程复杂，且存在散毒的风险，不适宜大批鸡群抗体水平的监测和流行病学调查等一系列推广和应用困难的问题。

鉴于DAV1对于养禽业危害的严重性，利用可靠快速的血清诊断技术对家禽进行血清学诊断是有效防控的基础。因此建立一种血清学诊断方法对DAV1进行准确的诊断的试剂盒，对该病的防治具有重要意义。

发明内容

本发明提出一种鸭腺病毒Ⅰ型Penton蛋白的应用，构建了鸭腺病毒Ⅰ型Penton蛋白的重组质粒，之后将该质粒加入到E.coli透析式无细胞重组蛋白体系并进一步将纯化的蛋白作为包被抗原建立试剂盒。

本发明的技术方案是这样实现的：

一种鸭腺病毒Ⅰ型蛋白，所述Penton蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。

上述鸭腺病毒Ⅰ型Penton蛋白的制备方法，步骤如下：

（1）合成Penton 基因，并将Penton基因连接至pET-11a 载体的NdeI 和 BamHI 之间，获得重组质粒pET-11a-Penton；

（2）将步骤（1）中测序正确的重组质粒pET-11a-Penton为模板加入到E.coli透析式无细胞重组蛋白体系，25℃静止16小时；

（3）收集经步骤（2）离心收集沉淀，通过Ni 柱亲和纯化最终获得上述鸭腺病毒Ⅰ型Penton 蛋白。

上述的Penton重组蛋白在制备检测鸭腺病毒Ⅰ型抗体的间接ELISA试剂盒中的应用，所述间接ELISA试剂盒包括表达蛋白ELISA酶标板、阴性对照血清、阳性对照血清、酶标二抗、酶标二抗稀释液、缓冲液、封闭液、稀释液、洗涤液、显色液和终止液。

所述表达蛋白ELISA酶标板以Penton重组蛋白作为包被抗原，每孔包被0.4μg所述重组蛋白Penton，阳性对照为抗鸭腺病毒Ⅰ型的鸡血清，阴性对照为SPF鸡血清。

所述稀释液或洗涤液均为含0.05％Tween-20的PBST，终止液为2M的H₂SO₄溶液，显色液为100mL TMB显色液。

本发明具有以下有益效果：