[发明专利]一种海水养殖尾水微生物净化制剂、其制备方法及其应用

权利要求书

1.一种海水养殖尾水生物膜微生物净化制剂的制备方法，其特征在于：所述生物膜微生物净化制剂的功能微生物由门多萨假单胞菌和施氏假单胞菌、ppuI基因过表达恶臭假单胞菌组成，还包括以下制备步骤，

制备混合菌液；

利用所述混合菌液制备混合菌体冻干粉；

其中所述混合菌液的制备包括门多萨假单胞菌培养液1~2份和施氏假单胞菌培养液1~2份、将ppuI基因过表达恶臭假单胞菌培养液2~3份复合调配；以及所述ppuI基因过表达恶臭假单胞菌还包括以下构建步骤：

提取恶臭假单胞菌基因组DNA；

以提取的基因组DNA为模板、以ppuI-F和ppuI-R为引物，对ppuI基因进行PCR扩增；

所述ppuI基因的PCR电泳条带经回收后，与经HindⅢ和BamHⅠ双酶切的载体pBBR1MCS-2连接，获得重组质粒；

将所述重组质粒转化至E.coliSM10感受态细胞，筛选得到阳性转化子；

利用接合转移将所述重组质粒转移至恶臭假单胞菌，经筛选及验证，得到所述ppuI基因过表达恶臭假单胞菌。

2.如权利要求1所述的海水养殖尾水生物膜微生物净化制剂的制备方法，其特征在于：所述混合菌液的制备包括，

设定所选菌体培养液的细菌浓度为4~8×10⁸CFU/mL。

3.如权利要求1或2所述的海水养殖尾水生物膜微生物净化制剂的制备方法，其特征在于：所述混合菌体冻干粉的制备包括以下步骤，

将所述混合菌液在转速为8000-10000r/min的条件下离心10min；

得到菌泥均匀分散于10mL、0.1-0.5mol/L的甘露醇和葡萄糖复配保护剂溶液中制成菌悬液；

将所述菌悬液于4℃预冷40min，投入液氮中预冻2h后，转移至冷冻干燥机中，进行真空干燥，得到混合菌体冻干粉；

所述混合菌体冻干粉置于4℃冰箱密封保存。

4.如权利要求1所述的海水养殖尾水生物膜微生物净化制剂的制备方法，其特征在于：所述ppuI基因过表达恶臭假单胞菌株包括，

随着细胞密度增加，能合成大量3-oxo-C10和3-oxo-C12信号分子。

5.如权利要求1所述的海水养殖尾水生物膜微生物净化制剂的制备方法，其特征在于：所述ppuI-F的序列如下，

CGCTCTAGAACTAGTGGATCCATGCTTATCTCCATTGATCGCCGC。

6.如权利要求1所述的海水养殖尾水生物膜微生物净化制剂的制备方法，其特征在于：所述ppuI-R的序列如下，

GTCGACGGTATCGATAAGCTTTCAATGGCAGTTATTCTTGATGG。

7.一种海水养殖尾水生物膜微生物净化制剂的应用，其特征在于：包括如权利要求1~6任一所述的生物膜微生物净化制剂，还包括以下应用步骤，

活化：将制成的混合菌体冻干粉复溶于无菌生理盐水中制成菌悬液，移植于斜面培养基上培养后，刮取菌苔进行扩大培养至浓度大于3×10⁸CFU/mL，得到微生物净化制剂；

投加：将活化后的微生物净化制剂直接均匀投加到海水养殖生物滤池中。

8.如权利要求7所述的海水养殖尾水生物膜微生物净化制剂的应用，其特征在于：包括以下步骤，

活化：将制成的混合菌体冻干粉复溶于无菌生理盐水中，制成菌悬液，移植于斜面培养基上培养后，刮取菌苔进行扩大培养至浓度大于3×10⁸CFU/mL，得到微生物净化制剂；

喷洒：将活化后的微生物净化制剂装入喷淋器，均匀喷洒到附着基上作为其他生物膜微生物的生物强化剂，置于海水养殖生物滤池下方进行挂膜强化培养。