[发明专利]一种海水养殖尾水微生物净化制剂、其制备方法及其应用

说明书

本发明公开了一种海水养殖尾水微生物净化制剂、其制备方法及其应用，所述生物膜微生物净化制剂的功能微生物包括ppuI基因过表达恶臭假单胞菌、门多萨假单胞菌和施氏假单胞菌。本发明有益效果：通过在恶臭假单胞菌中过表达指导信号分子3‑oxo‑C10和3‑oxo‑C12生物合成的ppuI基因，从而有效提高信号分子含量和附着基挂膜效率，提高生物膜总量；同时优化生物膜的群落组成及结构，并显著提高了海水养殖尾水中氨氮、亚硝酸盐、磷等污染物的净化效率，并减少经济成本。

技术领域

本发明涉及水产养殖和环境保护的技术领域，尤其涉及一种海水养殖尾水生物膜微生物净化制剂、其制备方法及其应用。

背景技术

近年来，随着海产品需求的增加以及渔业资源的衰竭，海水养殖规模不断扩大。在高密度海水养殖中需进行大量的施肥投饵，残饵、养殖动物排泄物和生物残骸容易引起养殖系统中氨氮、亚硝酸盐、磷等污染物超标。这些养殖尾水直接排放到临近水域，导致污染扩散、水环境恶化、水域富营养化等一系列问题，海水养殖已是我国近岸海域重要污染源之一，并成为制约我国海水养殖业可持续发展的重要因素。此外，研究表明，水体中的有机物和氨氮磷等无机物含量过高会造成养殖水质的恶化，影响养殖生物的正常生长，甚至造成死亡或泛池，严重时影响养殖生物质量与食用安全。

在海水养殖尾水处理技术中，生物膜法处理技术因具有运行稳定、管理方便、费用低等优点而得到广泛使用。该技术的主要原理是利用生物膜上微生物的新陈代谢作用，将污水中的有害物质最终分解为CO₂、N₂和H₂O。生物膜上的微生物包括细菌、真菌、藻类和原生动物等。其中，生物膜上的硝化菌、反硝化菌、聚磷菌等细菌在水质净化中起着主要作用，是生物膜法处理养殖为尾水的关键。因此如何优化生物膜挂膜效率以及生物膜的群落组成及结构，进而提高对特定污染物的去除效果成为了海水养殖尾水处理的研发目标。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明目的在于提供一种海水养殖尾水生物膜微生物净化制剂的制备方法及其应用。

为达上述目的，本发明提供如下技术方案：一种海水养殖尾水生物膜微生物净化制剂，所述生物膜微生物净化制剂的功能微生物包括ppuI基因过表达恶臭假单胞菌、门多萨假单胞菌和施氏假单胞菌。

一种海水养殖尾水生物膜微生物净化制剂的制备方法，包括以下步骤，制备混合菌液；利用所述混合菌液制备混合菌体冻干粉。

优选的，所述混合菌液的制备包括，将ppuI基因过表达恶臭假单胞菌培养液2~3份、门多萨假单胞菌培养液1~2份和施氏假单胞菌培养液1~2份复合调配；设定所选菌体培养液的细菌浓度为4~8×10⁸CFU/mL。

优选的，所述混合菌体冻干粉的制备包括以下步骤，将所述混合菌液在转速为8000-10000r/min的条件下离心10min；得到菌泥均匀分散于10mL、0.1-0.5mol/L的甘露醇和葡萄糖复配保护剂溶液中制成菌悬液；将所述菌悬液于4℃预冷40min，投入液氮中预冻2h后，转移至冷冻干燥机中，进行真空干燥，得到混合菌体冻干粉；所述混合菌体冻干粉置于4℃冰箱密封保存，制得的混合菌体冻干粉即为微生物净化制剂。

优选的，所述ppuI基因过表达恶臭假单胞菌包括以下构建步骤，提取恶臭假单胞菌基因组DNA；以提取的基因组DNA为模板、以ppuI-F和ppuI-R为引物，对ppuI基因进行PCR扩增；所述ppuI基因的PCR电泳条带经回收后，与经HindⅢ和BamHⅠ双酶切的载体pBBR1MCS-2连接，获得重组质粒；将所述重组质粒转化至E.coliSM10感受态细胞，利用重组质粒上Kan抗性基因筛选得到阳性转化子；利用接合转移将阳性转化子中的重组质粒转移至恶臭假单胞菌，利用重组质粒上Kan抗性基因进行筛选并进行qRT-PCR验证，得到所述ppuI基因过表达恶臭假单胞菌。