[发明专利]一种CK8基因表达检测试剂盒

说明书

本发明提供了一种CK8基因表达检测试剂盒，其包括针对检测CK8基因mRNA的捕获探针以及信号放大系统；所述信号放大系统包括扩增探针H1和扩增探针H2；每条捕获探针从5’端到3’端的碱基组成依次为：P1序列、间隔臂序列、特异性P2序列，且特异性P2序列从3’端到5’端的第2～9个碱基处有2～8个碱基进行了锁核酸修饰；每条扩增探针H1从5’端到3’端的碱基组成依次为：P3序列、P4序列；每条扩增探针H2从5’端到3’端的碱基组成依次为：P1序列、P5序列。上述试剂盒通过对捕获探针和信号放大系统的优化，可有效提高检测的灵敏度、准确率和检测效率，缩短检测时间，更好地满足CK8基因表达检测的需要。

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种CK8基因表达检测试剂盒。

背景技术

细胞角蛋白8(CK8)是一种II型碱性中间丝蛋白，属于细胞骨架蛋白家族，其基因定位于人类染色体12q13.13，包含10个外显子。CK8常与CK18结合，在肝细胞、胰腺腺泡和胰岛细胞、近端肾小管上皮细胞等多种上皮细胞中表达，在维持细胞结构完整性和信号转导及细胞分化中发挥作用(Karantza V.Oncogene,2011,30:127)。研究表明，CK8在肺癌、乳腺癌、结直肠癌、胃癌等多种肿瘤中异常表达，并与肿瘤的发生发展、侵袭、转移以及抗癌药物敏感性/耐药性有关(Karantza V.Oncogene,2011,30:127)。

在循环肿瘤细胞(CTCs)研究中，CK8常被作为上皮型标志物，用于CTCs的分离与鉴定。有研究联合过滤法和CK8抗体免疫染色法富集和计数乳腺癌患者血液中的CTCs，结果发现，远处转移患者CTCs检出率明显高于淋巴结阳性或淋巴结阴性患者，提示CK8阳性CTCs可能作为乳腺癌潜在的预后指标和疾病进展标志物(Kahn H J et al.,Breast CancerResearchTreatment,2004,86:237-247)。另有研究通过红细胞裂解法、免疫磁珠法结合CA19-9和CK8/18免疫荧光染色法来检测接受5-氟尿嘧啶化疗的晚期胰腺癌患者的CTCs，结果显示，5-氟尿嘧啶化疗一个周期后，患者CTCs检出率和数量明显减少，提示CTCs在胰腺癌中的存在可能作为评价化疗效果的指标(Ren C et al.,Cancer BiologyTherapy,2011,12:700-706)。可见，CK8在CTCs中的表达具有重要的临床价值。

鉴于CK8表达在肿瘤诊断、预后和治疗中的重要临床价值及其在CTCs研究中的重要意义，促使我们开发一种CK8基因表达检测试剂盒，该试剂盒将有助于深入研究CK8基因在各种肿瘤发生发展中的重要作用及其在肿瘤诊断、预后和治疗方面的临床意义，并将为肿瘤的诊断、预后和治疗提供有用的临床辅助信息。

目前常用的CK8表达检测方法主要有免疫组化和实时定量PCR。免疫组化是基于抗原与抗体特异性结合的原理，该方法具有操作简单、耗时短、检测成本低、染色后切片便于存档等优点；但是，其检测灵敏度和特异性有限，检测结果的准确性受诸多因素影响，并且检测所需组织样本取材受限。实时定量PCR主要是用于检测肿瘤组织/细胞样本中CK8mRNA表达水平，具有灵敏度高、序列特异性强等优点；但是，该方法对实验条件要求严格，每一步操作都必须严格避免污染，否则可能造成假阳性结果的产生。针对现有CK8基因表达检测方法存在的不足，中国专利CN201410228511.9提供了一种检测基因表达的RNA原位杂交方法，所述方法的检测探针可实现RNA原位检测的荧光信号放大，提高了检测的灵敏度和准确性，且检测样本可以为体液样本，应用范围广阔。但通过进一步研究发现，在保证甚至提高检测灵敏度和准确性的基础上，上述RNA原位杂交检测方法的杂交效率仍需要进一步优化，最好是能缩短检测时间，提高检测效率，对此，发明人也是做了多种努力和尝试。

发明内容

基于此，本发明的目的在于提供一种检测时间短且检测效果良好的CK8基因表达检测试剂盒(原位杂交法)，通过原位杂交法检测生物样本中CK8基因的表达水平，提供临床相关辅助信息。

具体技术方案为：