[发明专利]一种纯化酶、提取方法及试剂盒

说明书

本发明提供一种纯化酶、提取方法及试剂盒，属于酶提取技术领域。该方法是将动物内脏器官去杂、冲洗，得到处理后的样品；在处理后的样品中加入缓冲液，先使用打碎机进行打碎，然后再使用匀浆机进行细打碎，将样品进行盐析，溶解、然后进行离心，再过滤，冻干，得到冻干样品；使用冲洗缓冲液步骤四的冻干样本进行溶解，过滤，利用凝胶层析柱进行分离，再运用中空纤维柱技术对其进行换液、浓缩，即得到纯化酶。本发明还提供包括上述纯化酶的试剂盒。本发明的试剂盒综合性能高，灵敏度高。

技术领域

本发明属于酶提取技术领域，具有涉及一种纯化酶、提取方法及试剂盒。

背景技术

天然产物，其提取来源主要为动物的器官或者组织为主。与化学方法人工合成的酶相比，天然产物具有安全性高、代谢稳定等优势，但是动物天然产物的提取获得则存在不同程度的缺陷。目前，对纯化酶的提取主要采用动物细胞破壁、凝胶层析分离及浓缩等提取方式，主要分为机械破壁、生物化学破壁、凝胶层析技术、中空纤维柱技术等技术手段。

机械破壁主要以匀浆打碎法为主，借助破碎机、打碎机以及匀浆机等外力达到破壁使其原酶逸出的目的，其优点是获得原酶的浓度活性不会被破坏，但是在前期预处理、洗涤打碎过程中损失较大、操作复杂、工作量大，提取过程步骤复杂，单次处理原料样本有限，不适合处理大量样本。

生物化学破壁法以溶酶法为主要方式，主要用于蛋白质的提取，酶法提取具有选择性高的优势但受到成本控制的影响，价格较高，限制了大规模的利用，更重要的事，溶酶法通用性较差，不同来源的原酶样本提取时所需要选择不同的酶对其进行处理，局限性较大不适合量产，也对进一步纯化造成困难。

凝胶层析法以凝胶分离法为主，凝胶层析操作简便，所需设备简单。有时只要有一根层析柱便可进行工作。分离介质—凝胶完全不需要像离子交换剂那样复杂的再生过程便可重复使用。分离效果较好，重复性高。最突出的是样品回收率高，接近100％。分离条件缓和。凝胶骨架亲水，分离过程又不涉及化学键的变化，所以对分离物的活性没有不良影响。但是分辨率不高，分离操作较慢。由于凝胶层析是以物质分子量的不同作为分离依据的，分子量的差异仅表现在流速的差异上，所以分离时流速必须严格把握。因而分离操作一般较慢。而且对于分子量相差不多的物质难以达到很好的分离。此外，凝胶层析要求样品粘度不宜太高。凝胶颗粒有时还有非特异吸附现象。

中空纤维柱技术以超滤膜法为主，超滤技术分离效率高，对稀溶液中的微量成分的回收、低浓度溶液的浓缩均非常有效。超滤过程仅采用压力作为膜分离的动力，因此分离装置简单、流程短、操作简便、易于控制和维护。滤过程不发生相变化，无需加热，能耗低，无需添加化学试剂，无污染，是一种节能环保的分离技术。但是超滤法也有一定的局限性，它不能直接得到干粉制剂。对于蛋白质溶液，一般只能得到10～50％的浓度。

发明内容

本发明的目的在于提供一种纯化酶、提取方法及试剂盒，该提取方法能获得浓度高、纯度高的纯化酶，且该提取方法操作简单、成本低。

本发明首先提供一种纯化酶的提取方法，该方法包括：

步骤一：将动物内脏器官去杂、冲洗，得到处理后的样品；

步骤二：在步骤一处理后的样品中加入缓冲液，调节PH至7.0-9.5，先使用打碎机进行打碎，然后再使用匀浆机进行细打碎，每次打碎10-30min，间隔1-5h，然后放置于常温静置24-72h；

步骤三：将步骤二获得的静置后的样品进行盐析，溶解8h-24h，常温放置12-24h，然后进行离心，所述的离心速率为3000-11000r/min，离心时间为5-25min，再过滤，冻干，得到冻干样品；

步骤四：使用冲洗缓冲液步骤四的冻干样本进行溶解，然后使用3000-11000r/min离心5-25min，过滤，利用凝胶层析柱进行分离，再运用中空纤维柱技术对其进行换液、浓缩，即得到纯化酶。