[发明专利]一种条件敲除Foxp3基因鼠的构建方法

说明书

本发明提供了一种条件敲除Foxp3基因鼠的构建方法，属于基因工程技术领域，包括分别将EGE‑ZXC‑007‑sgRNA1和EGE‑ZXC‑007‑sgRNA9进行体外转录，得到RNA1和RNA9，再和打靶载体导入小鼠受精卵中，得到F0代小鼠，进行flox基因型检测，得到F0代阳性小鼠；将F0代阳性小鼠与野生型小鼠杂交，得到F1代小鼠，对F1代小鼠flox基因型检测，得到F1代阳性小鼠；将F1代阳性小鼠与组织特异性Cre小鼠杂交，得到floxed杂合子小鼠；将floxed杂合子小鼠与Cre‑deleter小鼠杂交，得到敲除Foxp3基因鼠。采用本发明提供的方法能够在特定组织敲除小鼠中的Foxp3基因。

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，尤其涉及一种条件敲除Foxp3基因鼠的构建方法。

背景技术

Foxp3是一种X-chromosome-encoded转录因子，属于forkhead/winged-helixfamily的转录调控因子，其对Treg细胞发育、分化及功能维持起重要支配作用，是目前最理想的Treg标记之一。Alexander等人在2010年证实Foxp3基因中保守的非编码DNA序列CNS1，CNS2和CNS3控制着小鼠Tregcells的发育和分化。其中，CNS2富含CpG，在成熟Treg中特异性去甲基化，其甲基化状态与Foxp3表达及其稳定性有关，敲除CNS2小鼠自发形成多器官炎性病变的淋巴组织增生性疾病。该基因已有敲除小鼠报道，半合子雄性具有autoimmunesyndrome表型，离乳后死亡。

分析基因结构，根据NCBI及ensembl数据库信息，小鼠该基因有4个转录本，编码同一种isoform(429aa)，主要在5'UTR形成可变剪切。基因5'端与正向lncRNA(Flicr)有重叠，3'端与反向基因Ccdc22有重叠。理论上现有的改造不会在结构上影响相邻基因的表达。

Foxp3基因结构域特性：Foxp3基因位于X染色体上，其cDNA序列全长3832bp,含有14个外显子，分别位于1-171，172-238,239-321，322-549,550-654，655-793,794-881,882-986,987-1074,1075-1155，1156-1309,1310-1386,1387-1488,1489-3832bp。CDS区位于343-1632bp。Foxp3调控区域：RegulatoryBuild红色部分为启动子及其所跨区域，调控Foxp3表达。Foxp3保守性区域：不同进化阶段生物体的基因组，或不同生物体的基因组中有些序列高度相似，这些相似的序列就是所谓的保守序列。

现有Foxp3基因敲除小鼠模型方案：一般利用同源重组的方法产生带有loxP位点的Foxp3等位基因的小鼠。Foxp3^low小鼠发育正常，没有自我免疫的迹象，通过杂交雌性Foxp3^+/low小鼠切除突变等位基因，产生Foxp3等位基因缺失小鼠。在现有模型中，对外显子的标示方式没有特别的规定，有些把ATG所在的外显子标为exon1，和目前数据库中的表示方法有些不同。另外，如果所参考的转录本不同的话，外显子标示的可能也不同(based onFontenot JD,et al.,EGE-ZXC-007 programs the development and function of CD4+CD25+regulatory T cells.Nat Immunol.2003 Apr；4(4):330-6)。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种条件敲除Foxp3基因鼠的构建方法，采用本发明提供的方法能够获得在特定组织敲除Foxp3基因鼠。

为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：

本发明提供了一种条件敲除Foxp3基因鼠的构建方法，包括以下步骤：

1)分别将EGE-ZXC-007-sgRNA1和EGE-ZXC-007-sgRNA9进行体外转录，得到RNA1和RNA9；