[发明专利]一种重组大肠杆菌及其在合成对羟基苯甲醛中的应用

说明书

本发明公开了一种重组大肠杆菌及其在合成对羟基苯甲醛中的应用，本发明以沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonas palustris)来源的细胞色素单加氧酶(CYP199A4)、铁氧化还原蛋白(HaPuR)和铁氧化还原蛋白还原酶(HaPux)为目的基因，pRSFduet‑1和pETduet‑1为载体，大肠杆菌E.coli BL21为宿主，成功构建了以茴香醛为底物生成对羟基苯甲醛的基因工程菌。以该重组大肠杆菌全细胞为催化剂，可在12h内将1g/L茴香醛转化为250mg/L对羟基苯甲醛。本发明提供的这种微生物全细胞转化对羟基苯甲醛的方法，具有反应条件温和、工艺简单、易于控制等优点，同时有利于环境保护，易于推广应用。

技术领域

本发明涉及一种重组大肠杆菌及其在合成对羟基苯甲醛中的应用，属于基因工程技术领域。

背景技术

对羟基苯甲醛是合成香料、药品等的重要有机中间体，在化工、农业、液晶、电镀及食品添加剂等领域具有广泛的用途。在农药领域，对羟基苯甲醛主要用于除草剂溴苯腈和羟敌草腈的合成；在医药领域，对羟基苯甲醛可用于合成羟氨苄青霉素、抗菌增效剂甲氧苄胺嘧啶、3,4,5-三甲氧基苯甲醛、对羟基甘氨酸、羟氨苄头孢霉素、人造天麻、杜鹃素、艾思洛儿等；在香料工业，对羟基苯甲醛主要用于合成香兰素、乙基香兰素、洋茉莉醛、丁香醛、茴香醛和复盆子酮等香料。此外，对羟基苯甲醛还可用于生产杀菌剂、照相乳化剂、镀镍光泽剂、液晶等。

对羟基苯甲醛的生产有多条工艺路线，目前工业生产主要有苯酚；对甲酚；对硝基甲苯等原料路线。(1)苯酚法苯酚法，又分为Reimer-Tiemann反应；Gattermann反应；苯酚-三氯乙醛路线；苯酚-乙醛酸路线；苯酚-甲醛路线等多种合成工艺路线。苯酚法的工艺特点是原料易得，制造工艺较简单，但收率偏低，成本较高。(2)对硝基甲苯法，对硝基甲苯法生产对羟基苯甲醛的工艺过程分氧化还原；重氮化和水解三步进行。(3)对甲酚催化氧化法，该工艺是在催化剂作用下，用空气或氧直接氧化对甲酚合成对羟基苯甲醛。

然而，以上方法均为化学合成法，存在环境污染、安全性等问题。目前也有采用能够直接发酵生成对羟基苯甲醛的菌株发酵生产对羟基苯甲醛，但是采用微生物直接发酵生产对羟基苯甲醛得到的发酵产物成分复杂，纯化难度较大。因此，利用生物催化方法生产对羟基苯甲醛符合绿色化学的要求，在工业生产中具有光明的应用前景，但目前相关技术很少且不成熟。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明利用P450酶CYP199A4的脱甲基特性，构建重组大肠杆菌，全细胞催化天然大茴香醛合成对羟基苯甲醛，提供了一种天然等同对羟基苯甲醛的制备方法。

本发明的第一个目的是提供一种重组大肠杆菌，所述的重组大肠杆菌是在大肠杆菌宿主中，以pRSFduet-1载体共表达细胞色素单加氧酶(CYP199A4)和铁氧化还原蛋白还原酶(HaPux)，以pETduet-1载体共表达铁氧化还原蛋白(HaPuR)和铁氧化还原蛋白还原酶(HaPux)得到。

进一步地，编码所述的细胞色素单加氧酶的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

进一步地，编码所述的铁氧化还原蛋白的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

进一步地，编码所述的铁氧化还原蛋白还原酶的基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.3所示。

进一步地，所述的大肠杆菌宿主为E.coli BL21。

本发明的第二个目的是提供所述的重组大肠杆菌的构建方法，包括如下步骤：