[发明专利]一种检测毛竹环状RNA表观遗传修饰的方法

说明书

本发明公开了检测毛竹环状RNA表观遗传修饰的方法，属于分子生物学领域。目前常用的RNA修饰检测方法，一般采用特异性RNA修饰的抗体，进行免疫沉淀，结合高通量测序来识别RNA修饰位点。而使用本方法首先纯化得到环状RNA，将环状RNA打断并3'端去磷酸化，基于ONT平台直接对RNA进行测序，即可获得环状RNA的多种表观修饰信息，如m⁶A、m⁵C，m¹A等。本发明首次提出了避免PCR扩增，直接从单碱基精度上检测环状RNA表观修饰位点的新型方法，克服了传统方法的繁琐流程与高额的抗体成本，这不仅丰富了检测环状RNA中表观修饰方法的多样性，也为探究环状RNA的结构和功能提供了新的思路。

技术领域

本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种检测毛竹环状RNA 表观遗传修饰的方法。

背景技术

在生物的转录过程中，大量mRNA前体可以通过反向剪接产生环状RNA (circularRNA)。与线性RNA不同，环状RNA具有共价闭环结构，没有5' 端帽子和3' 端poly(A) 尾巴。环状RNA不仅可以通过与线性RNA竞争的方式影响基因的表达，还可以充当microRNA(miRNA) 海绵体，吸附miRNA，调控靶基因的降解；或者与RNA结合蛋白相互作用，调控基因的转录。已有研究表明，一些环状RNA与神经元功能、先天免疫反应及细胞全能性密切相关。环状RNA还可以充当多种疾病诊断和治疗的潜在分子标记物，在人类疾病尤其是在癌症的发生与发展中起重要作用。此外，已有研究证实，环状RNA可通过内部核糖体进入位点（IRES）驱动翻译成蛋白质，如人体中与多聚核糖体相关的circ-ZNF609，包含一个从起始密码子开始的开放阅读框，结束于终止密码子，不依赖于5' 帽子即可翻译成蛋白质，从而控制成肌细胞的增殖。

随着RNA深度测序技术和生物信息学的发展，环状RNA的表观遗传修饰，引起了越来越多研究者的关注。常见的RNA修饰包括6-甲基腺苷（6-methyladenosine, m⁶A）、假尿苷（pseudouridine）、5-甲基胞苷（5-methylcytidine, m⁵C）、2'- O-核糖甲基化（2′-O-ribosemethylation）和1-甲基腺苷（1-methyladenosine, m¹A），这些修饰在很大程度上丰富了RNA的遗传与功能多样性。目前研究较多的是m⁶A修饰。作为最丰富的碱基修饰方式，m⁶A参与调控RNA的许多功能，在分子层面，m⁶A修饰主要参与调节RNA-蛋白质相互作用、RNA二级结构稳定性、RNA剪接及翻译调控，进而影响许多生理病理过程，如肥胖、胚胎发育、神经突触信号传递、肿瘤、精子发育等。已有研究证实，在环状RNA中存在保守的m⁶A基序和甲基化修饰位点，可调控环状RNA的翻译。此外，m⁶A修饰的环状RNA通过与YTHDF1 / YTHDF2蛋白相互作用可以调节mRNA的稳定性。由于检测技术的局限性，现有方法只能检测环状RNA中单一类别的修饰位点，很难从整体水平上揭示环状RNA表观遗传修饰的全局分布情况。例如，基于m⁶A抗体免疫沉淀，结合高通量测序技术（m⁶A-seq或MeRIP）鉴定RNA上m⁶A的修饰位点、应用m⁵C RNA免疫沉淀深度测序技术（m⁵C RNA immunoprecipitation sequencing, m⁵CRIP-seq）鉴定转录水平m⁵C修饰位点等。