[发明专利]人NRAS基因突变的数字PCR检测方法及应用

说明书

本发明提供了一种人NRAS基因突变的数字PCR检测方法及应用。具体地，提供了优选的针对NRAS Q61和NRAS G12所在序列的引物对、扩增方法、核酸探针以及检测体系，进一步还提供了用于检测NRAS基因突变的试剂盒。本发明通过优化的引物对和探针以及相应反应条件，从而可以对不同样本高灵敏度、强特异性地检测NRAS基因突变。

技术领域

本发明涉及基因检测领域，具体地，涉及人NRAS基因突变的数字PCR检测方法及应用。

背景技术

大鼠肉瘤病毒癌基因(rat sarcoma,RAS)家族成员编码的三磷酸鸟苷结合蛋白可以激活表皮生长因子受体(EGFR)下游的信号通路,进而调节细胞的生长、分化和凋亡。RAS基因家族成员包括KRAS、NRAS等。

RAS基因的突变可以导致其所编码蛋白的组成性激活。人类结直肠癌中存在一定的RAS突变几率，确定RAS基因状态对于结直肠癌靶向治疗药物的选择具有重要意义。大量研究表明，RAS基因发生突变后，会导致EGFR下游的信号通路异常活化，从而降低EGFR靶向药物(如西妥昔单抗和帕尼单抗)的药效。因此，检测RAS基因(主要包括KRAS、NRAS)的突变状态对于指导结直肠癌患者使用EGFR靶向药物具有重要意义。

然而，在实际检测结直肠癌患者的NRAS基因突变的过程中，仍然面临着检测样本质量等问题。尽管肿瘤组织和肿瘤细胞学样本是突变检测的最佳样本，但此类样本获取难度大。检测血浆中的游离核酸(Circulating free DNA,简称“cfDNA”),又称“液体活检”，避免了需要肿瘤组织的活检，在临床上是一种非常有用的诊断应用。使用液体活检提供了重复采血的可能性，从而允许在肿瘤发生过程中或者癌症治疗期间追踪cfDNA的变化，进而监控病情变化。

然而，采用无细胞的核酸(如cfDNA)作为肿瘤患者中的生物标志物存在一定难度，尤其是应用cfDNA检测准确并特异地检测基因突变目前存在巨大的技术挑战。首先，血液中的cfDNA含量因人而异，而且大部分情况都非常低,而其中肿瘤来源的游离核酸(Circulating tumor DNA,简称“ctDNA”)的质量更是参差不齐、含量高低不一。

不仅如此，cfDNA检测方法特异性有待提高。Douillard等人报道，使用血浆检测EGFR突变与肿瘤组织检测结果的符合度仅为65％。

此外，目前虽然有一些基于cfDNA来检测NRAS基因突变的方法，但是这些方法的灵敏度和特异性尚难以令人满意。

因此，本领域迫切需要开发基于cfDNA的高灵敏度和高特异性检测NRAS基因突变的方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种基于cfDNA的高灵敏度和高特异性检测NRAS基因突变的方法。

在本发明的第一方面，提供了一种用于检测基因突变的试剂，所述试剂选自下组：

(a)用于检测NRAS Q61突变的第一引物对，其中第一引物对包括SEQ ID No:1和2所示的引物；

(b)用于检测NRAS G12突变的第二引物对，其中第二引物对包括SEQ ID No:6和7所示的引物；

(c)上述(a)和(b)的组合。

在另一优选例中，所述的NRAS Q61所在序列位于NG_007572:7949～8055。

在另一优选例中，所述的NRAS Q61的野生型序列的核酸序列如SEQ ID NO.:10所示。

在另一优选例中，所述NRAS Q61K突变指NRAS蛋白氨基酸序列的第61位的谷氨酰胺Q突变为赖氨酸K(即Q61K)。

在另一优选例中，所述NRAS Q61R突变指NRAS蛋白氨基酸序列的第61位的谷氨酰胺Q突变为精氨酸R(即Q61R)。