[发明专利]一种快速构建血浆DNA测序文库的方法和试剂盒

说明书

本发明提供了用于构建血浆DNA测序文库的方法，包括以下步骤：1)抽提血浆DNA；2)任选将血浆DNA进行末端补平，获得末端补平后的血浆DNA；3)将任选末端补平后的血浆DNA进行3’悬A，获得3’悬A后的血浆DNA；4)将3’悬A后的血浆DNA与测序接头连接，获得连接产物；5)对连接产物进行纯化，获得纯化产物。本发明也提供用于构建血浆DNA测序文库的试剂盒。本发明大大简化了血浆DNA测序文库的构建流程，除去了由于PCR扩增造成的环境以及样本间的污染，降低了血浆DNA文库构建对环境的要求，同时也除去了由于PCR过程造成的基因组覆盖的不均一性，使得血浆样本文库构建更加低成本、高效、快速，血浆DNA测序结果更加真实、有效。

本申请是申请日为2014年6月24日、申请号为201410311003.7、发明名称为“一种快速构建血浆DNA测序文库的方法和试剂盒”的发明专利申请的分案申请。

技术领域

本发明涉及用于构建血浆DNA测序文库的方法和试剂盒，更具体地，本发明涉及用于构建高通量测序的血浆DNA文库构建的方法和试剂盒。

背景技术

随着科技的进步，传统的Sanger测序已经不能完全满足研究的需要，对基因组测序，需要费用更低、通量更高、速度更快的测序技术，高通量测序(也称第二代测序)技术应运而生。高通量测序技术的核心思想是边合成边测序，即通过捕捉新合成的末端的标记来确定DNA的序列，现有的技术平台主要包括Roche/454FLX、Illumina/Hiseq、Miseq、NextSeq和Life Technologies/SOLID system、PGM、Proton等。到目前为止，HiSeq 2000每个run可以达到6个人基因组30X覆盖的测序通量，约600G/run数据，在测序时间上Hiseq2500可以达到平均每8分钟读取一个碱基的速度。而且随着第二代测序技术的成熟，将其应用于临床的研究迅猛发展。

血浆DNA又称循环DNA，是血液中的细胞外DNA，长约几十到几百核苷酸，可以以DNA-蛋白质复合物的形式存在，也可以是游离的 DNA片段。正常情况下，血浆DNA来源于少量衰老死亡细胞的DNA 释放。健康状态下，循环DNA的生成与清除处于动态平衡状态，维持在较恒定的低水平。循环DNA能反映人体内细胞新陈代谢的状况，是健康评判的一个重要指标。外周血循环DNA量和质的改变与多种疾病 (包括肿瘤、复合性严重外伤、器官移植、妊娠相关疾病、感染性疾病、器官功能衰竭等)关系密切，作为一种无创性检测指标，有望成为某些疾病早期诊断、病情监测、疗效及预后评估的一种重要的分子标志物。

自从母体血液中的胚胎DNA被发现之后，无创伤地直接诊断和检测胚胎染色体异常性成了一个重大的研究课题。2008年，卢煜明教授及其团队率先使用高通量测序检测孕妇血浆DNA，统计染色体比例关系，血浆中微量的胚胎DNA的染色体数目的变化能被检测出来(Chiu,Chan et al.2008)。随着检测技术的逐渐完善成熟，各国都在致力于将该实验室技术转为临床应用。另有研究发现，癌症病人的癌细胞凋亡产物(包括断裂游离的癌细胞DNA)会释放到的血液中，随血液循环系统运送到全身，血浆DNA中携带有癌细胞基因组的全部遗传信息(Schwarzenbach, Hoon et al.2011)。近期，卢煜明教授发现通过对癌症病人血浆DNA进行高通量测序，以统计重复区甲基化状况，可以有效区分癌症患者和健康人群(Chan,Jiang et al.2013)。

测序效率的提升和多样品混合测序的普及对样品的制备效率提出了更高的要求，特别是大量临床样品制备；而现有的临床血浆样品制备方法的发展一直赶不上测序能力的提高。因此，第二代高通量测序临床血浆DNA样品的制备效率和成本，成为高通量测序能否得以普及的关键。