[发明专利]一种(S)-邻氯苯甘氨酸甲酯酶法合成方法

说明书

本发明公开了一种(S)‑邻氯苯甘氨酸甲酯酶法合成方法，所述方法为：以(R,S)‑邻氯苯甘氨酸甲酯为底物，以水解酶为催化剂，以pH 5‑9的缓冲液为反应介质构成转化体系，在20‑40℃、100‑200rpm条件下进行拆分反应，反应完全后，获得(S)‑邻氯苯甘氨酸甲酯；所述水解酶包括蛋白酶CES P‑1、蛋白酶6SD、固定化蛋白酶CES P‑1或固定化蛋白酶6SD。本发明固定化酶酶活回收率达95.91％，且可稳定使用15批次；固定化蛋白酶在三相体系中直接一步法不对称拆分(R,S)‑邻氯苯甘氨酸甲酯，底物浓度从2g/L提高至12g/L，最终可以获得29.26％光学纯(S)‑邻氯苯甘氨酸甲酯。

技术领域

本发明涉及酶固定化、酶催化、生化反应工程领域，具体涉及蛋白酶的固定化技术和固定化蛋白酶在三相体系中对映选择性生物拆分(R,S)-邻氯苯甘氨酸甲酯制备(S)-邻氯苯甘氨酸甲酯的方法。

背景技术

氯吡格雷是一类用于治疗动脉粥样硬化、中风和心脑血管等疾病的药物，能选择性地与血小板表面腺苷酸环化酶偶联的ADP受体结合，不可逆地抑制血小板活化，从而达到抑制血小板聚集的作用。第一代药物以氯吡格雷硫酸氢盐的形式销售。但后续研究发现，仅S-构型的氯吡格雷能有效抑制人体内血小板凝集，R-构型氯吡格雷用药后会导致抽搐副作用。因此，目前氯吡格雷均要求以单一S-构型上市销售。

(S)-邻氯苯甘氨酸甲酯是氯吡格雷的合成前体，化学名为2-氨基-2-(2-氯苯基)乙酸甲酯。传统的化学拆分工艺以(R,S)-邻氯苯甘氨酸甲酯为底物，通过手性试剂如酒石酸或樟脑磺酸与其发生化学反应，将外消旋体的一对对映体转化为非对映异构体，再利用非对映异构体物理性质的差异将其分步结晶分离，从而获得光学纯(S)-邻氯苯甘氨酸甲酯。该工艺存在手性拆分剂价格昂贵、废盐量大以及生产时间长等问题，是非环境友好型生产方式。

近年来，生物催化由于具有反应条件温和、光学纯度高、环境友好等优点在手性生物合成中的应用越来越广泛，因此，开发生物法选择性拆分(R,S)-邻氯苯甘氨酸甲酯制备(S)-邻氯苯甘氨酸甲酯的技术具有巨大的经济效益和社会效益。目前已有一些专利文献报道利用酶选择性拆分(R,S)-邻氯苯甘氨酸甲酯制备(S)-邻氯苯甘氨酸，但都需要对底物(R,S)-邻氯苯甘氨酸甲酯进行复杂的保护和脱保护，过程繁琐，得率低，不利于工业化应用。以(S)-邻氯苯甘氨酸甲酯为手性源合成(S)-氯吡格雷具有更高的原子经济性，然而，酶法一步直接拆分(R,S)-邻氯苯甘氨酸甲酯制备(S)-邻氯苯甘氨酸甲酯究报道很少。2014年薛屏等人使用固定化青霉素G酰化酶选择性拆分(R,S)-邻氯苯甘氨酸甲酯，反应30h后，底物转化率为62.5％，ee值为98％，E值为9.4，该反应反应时间长，且青霉素G酰化酶的立体选择性一般。

碱性蛋白酶在碱性条件下催化蛋白质分子水解为肽和氨基酸，细菌和芽孢杆菌是碱性蛋白酶的重要来源。近年来，研究人员发现，碱性蛋白酶具有与脂肪酶相似的酯水解能力，这可能与碱性蛋白酶与脂肪酶具有相同催化三联体(天冬氨酸-组氨酸-丝氨酸)有关。

固定化能改善酶的催化性能，相较于游离酶，固定化酶在保持高催化能力的同时，还可以反复利用，这大大提高了酶的使用率、降低了催化剂在生产成本中的比重。近年来，多壁碳纳米管因其尺寸小、表面积大、机械强度好，制备得到的固定化酶具有很高的催化能力和操作稳定性，在酶的固定化方面有巨大的应用潜力。

针对邻氯苯甘氨酸甲酯和邻氯苯甘氨酸的溶解性差异(邻氯苯甘氨酸甲酯易溶于有机溶剂，难溶于水且在水溶液中易自发水解；邻氯苯甘氨酸易溶于水溶液)，本发明发明一种由固定化酶、甲基叔丁基醚、磷酸钠缓冲液组成的三相反应体系(固-液-液)，并利用固定化蛋白酶在三相体系中一步法不对称拆分(R,S)-邻氯苯甘氨酸甲酯制备光学纯(S)-邻氯苯甘氨酸甲酯，该方法不仅有效提高了邻氯苯甘氨酸甲酯的溶解度，还有利于产物的下游分离提取。

发明内容