[发明专利]高产L-高丝氨酸的大肠杆菌基因工程菌、构建方法及菌株

说明书

本发明涉及一种产L‑高丝氨酸的大肠杆基因工程菌、构建方法及菌株。本发明大肠杆菌ZJUT H‑2/AS（Escherichia coli ZJUT H‑2/AS），保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC NO：M 2020233，保藏地址为中国武汉，武汉大学，邮编430072。本发明的有益效果主要体现在：（1）本发明针对ppc基因，pyc基因，iclR基因的改造可以减少发酵过程中乙酸等副产物的积累；（2）本发明中蔗糖代谢基因scrA，scrB和scrK可以通过合适的载体导入到其他工程菌株中使其获得高效代谢蔗糖的能力；（3）本发明诱变育种获得的L‑高丝氨酸的大肠杆基因工程菌相对原始菌株H‑0，L‑高丝氨酸产量提高了347%，能够作为基因工程菌的原始菌株。

(一)技术领域

本发明涉及高产L-高丝氨酸的大肠杆菌基因工程菌、构建方法，以及一株高产L-高丝氨酸的大肠杆菌基因工程菌菌株。

(二)背景技术

L-高丝氨酸(L-homoserine，2-amino-4-hydroxybutyric acid，HS)是苏氨酸、甲硫氨酸和胱硫醚生物合成的中间代谢物。因其丰富的生物活性和保湿能力被广泛地应用于医药，饲料和化妆品生产。L-高丝氨酸作为一种重要的平台化合物常通过酶法或者化学法转化为四氢叶酸，高丝氨酸环二酮哌嗪等产品。目前L-高丝氨酸主要依赖于化学法合成得到。

化学法中最常用的合成方法有两种。(1)甲硫氨酸法：通过与碘甲烷反应形成鎓盐，然后加水溶解回流，在碱性条件下生成高丝氨酸，收率为68％。此方法虽然收率高，但是碘甲烷的价格昂贵，反应时间太长。(2)以丁内酯原料，通过溴化，氨化，水解反应合成高丝氨酸，收率为70％。此方法原料易得，收率较高，但是提纯步骤繁琐，反应时间长达24h。此外，还能以L-天冬氨酸为原料，经过酯化、消旋、拆分后得到D-天冬氨酸甲酯，然后由D-天冬氨酸甲酯氨解得D-天冬酰胺，D-天冬氨酸甲酯还原得D-高丝氨酸所用原料易得，合成工艺简单，成本较低，流程短，实验条件易于控制，产品光学纯度较高，是具有潜在工业应用价值的合成路线。

大肠杆菌因其明确的基因背景，清晰的代谢网络，较短的生长周期而被广泛用于苏氨酸，蛋氨酸，琥珀酸等天然产物的发酵生产。在大肠杆菌中L-高丝氨酸的合成路径如下：首先，葡萄糖等碳源经过糖酵解后转化为磷酸烯醇式丙酮酸。部分磷酸烯醇式丙酮酸被羧化为草酰乙酸的补充到柠檬酸循环中，其余转化为丙酮酸后以乙酰辅酶A的形式进入柠檬酸循环最后同样可转化为草酰乙酸。以上两种方式产生的草酰乙酸经过天冬氨酸转氨酶作用后得到天冬氨酸。天冬氨酸经过天冬氨酸激酶(由thrA，metL，lysC编码)催化为β-天冬氨酰磷酸，后经天冬氨酸半醛脱氢酶(asd编码)催化为L-天冬氨酸-β-半醛，最后由高丝氨酸合成酶(由thrA，metL编码)催化为L-高丝氨酸。

(三)发明内容

本发明目的本发明目的是一种高产L-高丝氨酸的大肠杆菌基因工程菌、构建方法，以及一株高产L-高丝氨酸的大肠杆菌基因工程菌菌株。

本发明采用的技术方案是：

高产L-高丝氨酸的大肠杆菌基因工程菌，由如下方法构建获得：

(1)将大肠杆菌E.coli W3110中metI、metJ、metB、thrB、metA和lysA基因敲除，并且过表达metL基因，构建得到菌株E.coli W3110 ΔmetI ΔmetJΔmetBΔthrB ΔmetA ΔlysATrc-metL，记为E.coli H-0；