[发明专利]表达猪繁殖与呼吸综合征病毒GP3/GP5/M基因的重组伪狂犬病毒、构建方法和应用

说明书

本发明属于基因重组和疫苗技术领域，本发明先用带三种不同启动子HPPRRSV或类NADC30毒株的GP3‑GP5‑M基因替换TK基因，而后用IL‑18‑IFN‑γ替换gG基因得到，成功构建并拯救了6种以IL‑18和IFN‑γ作为免疫佐剂，表达PRRSV的GP3‑GP5‑M基因的重组伪狂犬病毒，该重组伪狂犬病毒能够在PK‑15细胞上连续传代至少15代均能出现稳定病变，并稳定表达外源基因，说明6种重组病毒均具有良好的遗传稳定性及体外复制能力，该发明提供了构建对抗PRV和PRRSV共感染的二价候选疫苗的方法，为治疗和预防猪繁殖与呼吸综合征病毒与猪伪狂犬病毒疾病感染提供候选疫苗株。

技术领域

本发明涉及基因重组和疫苗技术领域，更具体地，涉及表达猪繁殖与呼吸综合征病毒GP3/GP5/M基因的重组伪狂犬病毒、构建方法和应用。

背景技术

猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndromevirus，PRRSV)引起的一种高度接触性和高死亡率的传染病，其主要症状是出现母猪繁殖障碍和新生仔猪呼吸道疾病，2006年出现的高致病性株和2014年出现的类NADC30毒株对全球养猪业产生了巨大的负面影响。PRRSV病毒粒子呈球形，有囊膜，直径约为45～65nm，属于动脉炎病毒科(Arteriviridae)、动脉炎病毒属(Arterivirus)，是不分节段、有囊膜的单股正链RNA病毒，基因组全长约为15kb，基因组5’端有“帽子”结构和非编码区(5’Untranslatedregion,5’UTR)，3’端有Poly(A)尾巴以及非编码区(3’Untranslated region,3’UTR)。

研究表明，PRRSV的GP5、GP3和M基因与其保护性免疫相关。PRRSV主要通过黏膜表面感染猪，因此，黏膜免疫和全身免疫的诱导是抑制PRRSV进入的关键。目前，商业化的PRRSV疫苗包括灭活和现有改良的活疫苗，商业PRRSV疫苗是通过肌肉免疫接种的，这不能诱导有效的黏膜免疫反应来防止PRRSV通过黏膜表面进入。因此，开发安全有效的疫苗对于该病的防控具有重大意义。

伪狂犬病(Pseudorabies，PR)，也被称为猪I型疱疹病或奥耶兹氏病，是由伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus，PRV)引起的以新生仔猪的神经症状和死亡、育肥猪的呼吸系统疾病和妊娠母猪的生殖功能障碍为主要表现的传染性疾病。PRV属于α疱疹病毒亚科，疱疹病毒I型，目前该病毒只有一个血清型。PRV基因组为线性双链DNA，大小约为142kb，可编码70～100种病毒蛋白，其中PRV基因含有大量与病毒增殖无关并可插入目的基因的非必需区域，是优良的活病毒载体。PRV的TK、gI、gE、gG、PK等基因是PRV的非必需基因，但又是重要的毒力基因，这些基因的缺失有可能降低病毒毒力，且不影响PRV的免疫力。PRV Bartha-K61是一株应用广泛的疫苗株，清晰的遗传背景为其作为疫苗载体在安全性上提供了有力保障。

猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)和猪伪狂犬病(PR)作为临床上两种非常重要的传染病严重制约着全球养猪业，给养猪业造成的经济损失巨大。因此，亟需开发利用重组活载体疫苗，以更好地防御PRV和PRRSV引起的疾病。

发明内容

本发明为了克服现有技术中缺乏同时抵抗猪伪狂犬病和猪繁殖与呼吸综合征的疫苗的缺陷，采用Red/ET重组技术与Cre/loxP位点特异性重组系统相结合，最终获得猪繁殖与呼吸综合征病毒基因的重组伪狂犬病毒，其有望作为猪繁殖与呼吸综合征病毒基因的重组伪狂犬病毒的候选疫苗株。

本发明的首要目的是提供一种含PRV的非必需基因同源臂的pBR322载体的中间转移载体。

本发明的第二个目的是提供含有上述中间转移载体的重组子。

本发明的第三个目的是提供上述中间转移载体在构建重组伪狂犬病毒中的应用。