[发明专利]一种金黄色葡萄球菌转座子测序文库及构建方法

权利要求书

1.一种金黄色葡萄球菌转座子测序文库的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

（一）质粒构建：先构建质粒骨架和转座子，再合成完整pSATn21质粒；

（二）质粒转化：将上一步所得pSATn21质粒转入DC10B修饰后再转入金葡菌Newman标准菌株；

（三）诱导转座：将上一步所得菌株经培养基培养、诱导转座和洗脱，获得文库；

（四）文库验证：在mmeⅠ酶切位点切割该位点下游一定数量的核苷酸序列，通过酶切后将得到一段带有转座子片段及一定数量来自于金葡菌Newman基因组的融合片段，通过加接头PCR富集的方式，进行高通量测序。

2.如权利要求1所述的金黄色葡萄球菌转座子测序文库的构建方法，其特征在于，所述构建质粒骨架，包括：

S101）克隆青霉素耐药基因、pRB322质粒复制元件、金葡菌温敏质粒元件，获取片段；

S102）氯霉素耐药基因cat，获取片段；

S103）脱水四环素诱导启动子，获取片段；

S104）基于NCBI公布序列合成marine转座酶及其基因下游47bp，获取片段；

S105）使用Gibson装配即无缝克隆将S101）至S104）获得四个片段依次装配成一个完整质粒骨架。

3.如权利要求1所述的金黄色葡萄球菌转座子测序文库的构建方法，其特征在于，所述构建转座子，使用带有IRTs即反向重复序列的引物从转座子Tn917中扩增红霉素耐药基因形成转座子；同时该反向重复序列中加入了后续用于构建Tnseq方法的mmeⅠ酶切位点，使得该文库可用于Tnseq转座子测序。

4.如权利要求1所述的金黄色葡萄球菌转座子测序文库的构建方法，其特征在于，所述合成完整质粒，包括：

S301）使用sacⅡ限制性内切酶消化构建的质粒骨架，并去磷酸化；

S302）使用sacⅡ限制性内切酶消化构建的转座子；

S303）将S301）的S302）获得的两片段使用T4DNA连接酶连接形成完整pSATn21质粒。

5.如权利要求1所述的金黄色葡萄球菌转座子测序文库的构建方法，其特征在于，所述步骤（三）诱导转座，具体过程：

S31）将pSATn21转化所得的菌株放入30℃，氯霉素10 μg/ml的培养基中培养过夜；

S32）再将所得菌株加入红霉素5 μg/ml，脱水四环素150 ng/ml，43℃诱导转座，该转座效率约为10-6左右，每个平板10……8cfu，约得到100-300个突变文库菌株；

S33）洗脱500个平板上单克隆菌株，约得到100,000个克隆的文库。

6.一种通过如权利要求1至5任一所述的金黄色葡萄球菌转座子测序文库的构建方法构建的金黄色葡萄球菌转座子测序文库。