[发明专利]一种金黄色葡萄球菌转座子测序文库及构建方法

说明书

本发明公开了一种金黄色葡萄球菌转座子测序文库及构建方法，所述构建方法包括：（一）质粒构建：先构建质粒骨架和转座子，再合成完整pSATn21质粒；（二）质粒转化：将pSATn21质粒转入DC10B修饰后再转入金葡菌Newman标准菌株；（三）诱导转座：将上一步所得菌株经培养基培养、转座和洗脱，获得文库；（四）文库验证：在mmeⅠ酶切位点切割该位点下游一定数量的核苷酸序列，得到一段带有转座子片段及一定数量来自于金葡菌Newman基因组的融合片段，通过加接头PCR富集的方式，进行高通量测序。本发明构建方法随机性更高，转座子随机插入至金黄色葡萄球菌基因组的TA位点中，且无偏嗜性；构建的文库为后期高通量筛选细菌耐药、不同条件下的生存能力等奠定基础。

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种金黄色葡萄球菌转座子测序文库及构建方法。

背景技术

金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus，S. aureus)也称“金葡菌”，隶属于葡萄球菌属，是革兰氏阳性菌代表，为一种常见的食源性致病微生物。该菌最适宜生长温度为37℃，pH为7.4，耐高盐，可在盐浓度接近10%的环境中生长。金黄色葡萄球菌常寄生于人和动物的皮肤、鼻腔、咽喉、肠胃、痈、化脓疮口中，空气、污水等环境中也可存在。因而，食品受其污染的机会很多。近年来，美国疾病控制中心报告，由金黄色葡萄球菌引起的感染占第二位，仅次于大肠杆菌。金黄色葡萄球菌肠毒素是个世界性卫生难题，在美国由金黄色葡萄球菌肠毒素引起的食物中毒，占整个细菌性食物中毒的33%，加拿大则更多，占到45%，中国每年发生的此类中毒事件也非常多。然而耐药性的产生与广泛传播严重干扰着金葡菌的临床防治，使得近年来金葡菌感染逐步呈现发病率高、耐药性强、治疗困难、病死率高的态势。基于金葡菌在临床感染性疾病中的重要地位，探寻金葡菌的形成机制对于有效控制金葡菌感染具有重要意义。

探寻金葡菌的形成机制，关键在于分离鉴定与金葡菌形成相关的基因。而文库筛选是鉴定持留相关基因的最常用方法。DNA转座子 (Transposon) 是一类能在真核生物染色体上不断移动位置的功能性DNA片段，对发现新基因和分析基因功能具有重要的作用，被认为是导致真核生物遗传变异的主要原因之一。

发明内容

本发明的一个目的在于提供一种金黄色葡萄球菌转座子测序文库及构建方法。

为了达到上述目的，本发明技术方案如下：

一种金黄色葡萄球菌转座子测序文库的构建方法，包括以下步骤：

（一）质粒构建：先构建质粒骨架和转座子，再合成完整pSATn21质粒；

（二）质粒转化：将上一步所得pSATn21质粒转入DC10B修饰后转入金葡菌Newman标准菌株；

（三）诱导转座：将上一步所得菌株经培养基培养、转座和洗脱，获得文库；

（四）文库验证：在mmeⅠ酶切位点切割该位点下游一定数量的核苷酸序列，通过酶切后将得到一段带有转座子片段及一定数量来自于金葡菌Newman基因组的融合片段，通过加接头PCR富集的方式，进行高通量测序。

进一步的，所述构建质粒骨架，包括：

S101）克隆青霉素耐药基因、pRB322质粒复制元件、金葡菌温敏质粒元件（pKOR1），获取片段；

S102）氯霉素耐药基因cat（pKOR1），获取片段；

S103）脱水四环素诱导启动子（pRAB11），获取片段；

S104）基于NCBI公布序列合成marine转座酶及其基因下游47bp，获取片段；

S105）使用吉布森装配即无缝克隆将S101）至S104）获得四个片段依次装配成一个完整质粒骨架。