[发明专利]一种高效获得无嵌合体四倍体厚朴植株与细胞的方法

权利要求书

1.一种高效获得无嵌合体四倍体厚朴植株与细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1、制备孔径大小为100-200μm胚性细胞团诱导材料；

步骤2、用不同浓度秋水仙素处理100-200μm胚性细胞团；

步骤3、清洗秋水仙素处理过的诱导材料，将清洗过秋水仙素的诱导材料置于M2固体培养基上进行培养；

步骤4、四倍体细胞与植株鉴定；

步骤5、厚朴四倍体细胞分化胚，体细胞胚分化植株以及四倍体厚朴组培苗的驯化和移栽；

所述步骤1中的制备孔径大小为100-200μm胚性细胞团诱导材料具体为：

挑取于继代培养基M1上培养的每隔2周继代一次且发育良好的500mg厚朴胚性愈伤组织，放入20ml不含2,4-二氯苯氧乙酸的M2液体培养基的50ml三角瓶中；加入用75％酒精清洗过的磁力搅拌子，磁力搅拌子的大小为7mm*30mm，置于IKA C-MAG HS7磁力搅拌器于0℃、1250rpm进行细胞团的打碎分散，10分钟以后取下并分别过100-200μm筛子，得到较为均一的胚性细胞团；

所述的继代培养基M1配方如下：木本植物培养基+1mg/L 2,4-二氯苯氧乙酸+1g/L聚乙烯聚吡咯烷酮(Polyvinylpyrrolidone，PVP)+1g/L酪蛋白水解物+30g/L蔗糖+3g/L植物凝胶+1g/L活性炭，pH 5.8；不含2,4-二氯苯氧乙酸的M2液体培养基配方如下：木本植物培养基+1g/L聚乙烯聚吡咯烷酮+30g/L蔗糖，pH 5.8；

所述步骤2中的用不同浓度秋水仙素处理100-200μm胚性细胞团具体为：称取秋水仙素90mg于含有少量蒸馏水的三角瓶中，并定容至6ml，1.5％w/v，然后进行过滤灭菌；吸取2mL秋水仙素母液分别加入到含有13mL ECAs的50ml三角瓶中，使最终的浓度为0.2％(w/v)；然后将其分装到体积为50ml的三角瓶中，每个三角瓶5mL，然后将其置于转速为120rpm，环境温度为25℃的摇床中，黑暗条件下培养72h；

所述步骤3中的清洗秋水仙素处理过的诱导材料，将清洗过秋水仙素的诱导材料置于M2固体培养基上进行培养具体为：秋水仙素处理达到一定时间后，取出三角瓶将秋水仙素处理过的胚性细胞团悬浮液倒入倾斜放置的9cm培养皿，静置一段时间，直到细胞团沉于底部为止，弃去上清液，加入不含秋水仙素的M2液体培养基5ml，再次静置沉淀，直到细胞团沉于底部为止，再次弃去上清液，如此重复三次；吸取1mL ECAs于三层滤纸上，并将含有ECAs的最上层滤纸转移至含有25ml M2固体培养基9cm培养皿中，置于L:D＝16h:8h，温度为25℃的无菌操作间进行培养；一个月后将M2固体培养基上再生的单克隆转移至新鲜的M2固体培养基；

M2液体培养基配方如下：木本植物培养基+1g/L聚乙烯聚吡咯烷酮+30g/L蔗糖，pH5.8；

M2固体培养基配方如下：木本植物培养基+1g/L聚乙烯聚吡咯烷酮+30g/L蔗糖+3g/L植物凝胶+1g/L活性炭，pH 5.8；

所述步骤4中的四倍体细胞与植株鉴定具体为：取生长周期大小为3个月的秋水仙素处理过的小植株/细胞以及对照组小植株/细胞进行倍性鉴定，取200mg的叶片/细胞于1mlWPB解离液浸没叶片，并用不锈钢白金刃口双面刀片将叶片切碎，15min后利用CellTricsdisposable filters-30μm对其进行过滤，弃去沉淀；往过滤后的液体中分别加入50μg/mLRNase，50μg/mL PI染色剂，染色30min，避光；

所述步骤5中的厚朴四倍体细胞分化胚，体细胞胚分化植株以及四倍体厚朴组培苗的驯化和移栽具体为：

步骤5.1、将继代培养2周的厚朴胚性细胞团转入体细胞胚分化和萌芽培养基上进行分化培养；体细胞胚分化和萌发培养基的组成为WPM+1g/L活性炭+30g/L蔗糖+3g/L Phytagel+1g/L聚乙烯聚吡咯烷酮，pH 5.8；培养条件为恒温25℃暗培养；经过1个月的培养，胚性细胞团可以分化大量的体细胞胚；

步骤5.2、在体视显微镜下将子叶胚阶段的成熟体细胞胚捡出，转入装有20mL体细胞胚分化和萌发培养基的培养皿上进行萌发培养；培养条件为25℃恒温，光周期16/8h，光照强度60μmol m^-2s^-1；在体细胞胚根伸出，子叶发育展开时，转入装有50ml M2固体培养基的250ml组培瓶中上继续培养；

步骤5.3、将生根的厚朴组培苗从组培瓶中取出，自来水冲洗，将附着在组培苗上的植物凝胶清洗干净，转入栽培基质中；栽培基质为泥炭土与珍珠岩，并高温灭菌，灭菌后的栽培基质装入到规格为133mm*173mm长方形白色塑料盒保鲜盒中，底层为珍珠岩，厚度为30mm，上层为均匀混合的质量比为3:1的泥炭土与珍珠岩，厚度为50mm，将移入组培苗的保鲜盒转移至高浓度CO₂间，800ppm CO₂、温度为22℃、相对湿度为60％，盖上保鲜膜保持湿度，每周浇霍格兰氏液1mL/株，并不定期适当浇水，培养2周后将保鲜膜打孔，并转移至温度为21℃，湿度70％常规土培培养间培养，1周后揭掉保鲜膜；

霍格兰氏液配方如下：大量元素(100×)10ml/L，铁盐(200×)5ml/L，微量元素(500×)2ml/L；100×表示母液大量元素浓度配制成了100倍；200×表示母液铁盐浓度配制成了200倍，500×表示母液微量元素浓度配制成了500倍；大量元素(100×)中的母液元素及扩大了100倍的浓度包括：Ca(NO₃)₂·4H₂O 23.8512g/L；NH₄H₂PO₄ 1.4952g/L；KNO₃ 51.561g/L；MgSO₄·7H₂O 5.9939g/L；铁盐(200×)中的母液元素及扩大了200倍的浓度包括：Na₂EDTA1.6602g/L，FeSO₄·7H₂O 0.311375g/L；微量元素(500×)中的母液元素及扩大了500倍的浓度包括：H₃BO₃ 0.2993g/L，MnCl₂·4H₂O 0.201g/L，ZnSO₄·7H₂O 0.0451g/L，CuSO₄·5H₂O0.0262g/L，H₂MoO₃·H₂O 0.0113g/L，Co(NO₃)₂·6H₂O 0.0125g/L，NH₄NO₃ 1.1726g/L。