[发明专利]一种高效获得无嵌合体四倍体厚朴植株与细胞的方法

说明书

本发明公开了一种高效获得无嵌合体四倍体厚朴植株与细胞的方法，包括以下步骤：制备孔径大小为100‑200μm胚性细胞团诱导材料，用不同浓度秋水仙素处理100‑200μm胚性细胞团，处理后的胚性细胞团的生长与植株的再生，四倍体细胞与植株鉴定，厚朴四倍体细胞分化胚，体细胞胚分化植株以及四倍体厚朴组培苗的驯化和移栽。本发明所提供的高效获得无嵌合体多倍体植株与细胞的方法能显著地提高厚朴二倍体的加倍效率，且解决了多倍体育种过程中容易产生嵌合体的这一关键技术难题，从而大大提高了多倍体育种效率，使大规模应用多倍体育种技术产生无嵌合体多倍体植株与细胞成为可能。

技术领域

本发明属于生物育种技术领域，具体地说，涉及一种高效获得无嵌合体四倍体厚朴植株与细胞的方法。

背景技术

厚朴(Magnolia officinalis Rehd.et Wils.)是木兰科(Magnoliaceae)木兰属(Magnolia)植物。厚朴的树皮、根皮、枝皮和花果均可入药。厚朴树皮为传统中药，在我国已有两千多年药用历史。厚朴的主要活性成分有厚朴酚、和厚朴酚、厚朴碱、挥发油、β-桉叶醇等，其中主要活性成分厚朴酚(C18H18O2)与和厚朴酚(C18H18O2)具有抗肿瘤，抗菌、抗溃疡、抗抑郁及防龋作用。厚朴不仅具有重要的药用价值，而且也有较高的观赏价值。由于其药用价值野生厚朴被过度砍伐，资源和分布急剧下降，被列为国家二级保护野生植物。

天然状态下的厚朴为二倍体，厚朴体细胞染色体数为2n＝38，其中中部着丝点染色体(m)为16对，近中部着丝点染色体(sm)为2对，近端部着丝点染色体(st)为1对，其核型公式为K(2n)＝19X＝38＝32m+4sm(2SAT)+2st。

嵌合体是目前多倍体育种中普遍遇到的问题，加倍的组织或者细胞无法及时的从嵌合体中分离出来，就会被生长旺盛的正常二倍体细胞包围，最终消失，植株恢复成原有倍性，致使诱导失败。由多细胞的组织作为诱导材料，容易产生嵌合体，如外植体茎尖诱导、叶柄诱导、叶片、顶芽。即使诱导鉴定为多倍体后，后期增殖过程中又出现二倍体，需要不断的纯化，由于秋水仙素诱导染色体加倍的前提是细胞处于分裂期，而这些多细胞组织在秋水仙素处理的有限时间内，很难达到所有细胞都处于分裂期，因此未处于分裂期的细胞就未加上倍，也就产生了嵌合体。

因此，有必要提供一种高效获得无嵌合体多倍体植株与细胞的方法。

发明内容

有鉴于此，本发明针对上述的问题，提供了一种高效获得无嵌合体四倍体厚朴植株与细胞的方法，是通过以100-200μm胚性细胞团(ECAs)为诱导材料，由于诱导材料胚性细胞团孔径是目前为止染色体加倍报道里面最小的，最接近单细胞起源，因此可以避免嵌合体。

为了解决上述技术问题，本发明公开了一种高效获得无嵌合体四倍体厚朴植株与细胞的方法，包括以下步骤：制备孔径大小为100-200μm胚性细胞团诱导材料，用不同浓度秋水仙素处理100-200μm胚性细胞团，处理后的胚性细胞团的生长与植株的再生，四倍体细胞与植株鉴定，厚朴四倍体细胞分化胚，体细胞胚分化植株以及四倍体厚朴组培苗的驯化和移栽。

可选地，具体包括以下步骤：

步骤1、制备孔径大小为100-200μm胚性细胞团诱导材料；

步骤2、用不同浓度秋水仙素处理100-200μm胚性细胞团；

步骤3、清洗秋水仙素处理过的诱导材料，将清洗过秋水仙素的诱导材料置于M2固体培养基上进行培养；

步骤4、四倍体细胞与植株鉴定；

步骤5、厚朴四倍体细胞分化胚，体细胞胚分化植株以及四倍体厚朴组培苗的驯化和移栽。

可选地，所述步骤1中的制备孔径大小为100-200μm胚性细胞团诱导材料具体为：