[发明专利]基于茶树逆转录转座子序列开发的IRAP分子标记及其应用

说明书

本发明涉及基于茶树逆转录转座子序列开发的IRAP分子标记及其应用，属于生物技术领域，本发明基于Ty3‑gypsy逆转录转座子转录酶序列成功开发了IRAP分子标记，该IRAP分子标记即引物F1R2、F4R1或F6R1可对不同茶树进行种质区分，结果稳定、效率高、不易收环境影响，可以有效的运用于各地区茶树种质资源的物种分析以及物种亲缘关系分析方面的研究，为茶树的种质鉴定、亲缘关系分析以及遗传多样性分析等研究领域提供新的途径。对茶树的种质资源上的优种改良、培育、鉴别茶树培养的变异方法等方面有很大的意义。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体的说，涉及基于茶树逆转录转座子序列开发的IRAP分子标记及其应用。

背景技术

茶树(Camellia sinensis L.O.Ktze)为山茶科山茶属的多年生木本植物，起源于我国的西南和华南地区。近年来，经过全国范围内的资源调查及系统整理，茶树分类系统逐渐完善，但由于在进化中频发复杂的杂交和变异，现存的茶树物种系统分类研究仍存在诸多分歧。茶树物种分类主要以形态学特征为依据，近年来，随着生物学各类技术的应用，茶树物种分类需基于形态学、生物化学、分子生物学等多元证据才可得出较可靠的结果。其中，DNA分子标记以快速且相对准确的特点弥补了传统形态标记分类法的不足，成为现代茶树分类学研究的有力工具。诸如环境响应、数量性状等复杂的茶树遗传现象，在 DNA分子标记的帮助下已经陆续开展，如RAPD、ISSR、AFLP、DNA条形码等已在茶树物种鉴别、遗传多样性分析、分类演化等研究领域得到了广泛的应用。但它们也有缺点，例如RAPD标记易受环境影响，所得结果稳定性和重复性较差；ISSR标记呈孟德尔遗传，难以区分显性纯合基因型和杂合基因型；显性标记AFLP对DNA的纯度及内切酶的质量要求高，并且步骤复杂，成本高。目前，针对茶树在种质资源上的分类以及对于良种选育的分子标记研究，我们仍然缺乏有效的方法及知识。

转座元件是高等植物基因组的重要组成部分，分为转座子和逆转录转座子；其中，植物逆转录转座子是植物中最为丰富的一类转座元件，在1984年由Shepherd在玉米中首次发现，经研究，逆转录转座子在植物基因和基因组的结构及进化上具有极其重要的作用，是影响植物基因组大小、进化和基因多样性的重要原因之一。逆转座根据末端是否包含长重复序列可分为LTR和non-LTR逆转座子两类。针对LTR 逆转座子，根据其编码区蛋白基因的不同又分为Ty1-copia和Ty3-gypsy两个亚类。逆转录转座子具有长度多样性及种间和种内序列的多样性，且在显示出插入多态性，诱发基因突变，导致生物进化中基因组的多样性^[8]，这些特性决定了逆转录转座子具有开发分子标记的潜力。目前基于LTR逆转录转座子已建立了多种分子标记技术，包括SSAP(序列特异性扩增多态性)、IRAP(逆转座子位点扩增多态性)、 RBIP(基于逆转座子插入多态性)及REMAP(逆转座子－微卫星扩增多态性)。以上转录转座子的分子标记相对于常规分子标记来说，逆转录转座子的分子标记更具有明显优势，主要表现为覆盖范围广，基本包括整个植物基因组，信息量大，灵敏度和多态性高等特点。

茶叶是云南省比较重要的农业经济产物，茶树种质资源非常丰富，随着农业科学技术的发展，茶树选育品种越来越多，但种质材料间的差异越来越小，单纯依靠表现型很难进行区分。逆转录转座子所涉及到的应用广泛，但在茶树中还未得到实践应用，加上我国目前对茶树系统分类的研究缺少相应的生物学依据跟技术手段，因此希望通过IRAP分子标记对茶树种质资源进行研究，建立茶树逆转录转座子研究方法，开发可区分不同物种的特异分子标记，为茶树种质资源评价、优良基因的发掘和利用、茶树良种培育等研究奠定基础。

发明内容

本发明基于Ty3-gypsy逆转录转座子转录酶序列成功开发了IRAP分子标记，该IRAP分子标记即引物F1R2、F4R1或F6R1可对不同茶树进行种质区分，结果稳定、效率高、不易收环境影响，可以有效的运用于各地区茶树种质资源的物种分析以及物种亲缘关系分析方面的研究，为茶树的种质鉴定、亲缘关系分析以及遗传多样性分析等研究领域提供新的途径。

为实现上述目的，本发明是通过如下技术方案实现的：