[发明专利]一种基于尺寸排阻层析与超滤结合的细胞外囊泡分离方法

权利要求书

1.一种小细胞外囊泡分离方法，包括以下步骤：

S1.样本准备：将血清/血浆样本离心去除细胞，离心去除细胞碎片血小板，得上清液A；或将细胞培养上清或其他含有小细胞外囊泡的生物体液离心去除残余细胞及细胞碎片，得上清液B；

S2.将步骤S1中上清液A或上清液B进行尺寸排阻层析，收集洗脱液，并依据洗脱顺序将部分洗脱液合并为一定组分，得粗提小细胞外囊泡溶液C；

S3.将步骤S2所述小细胞外囊泡溶液C进行超滤浓缩，得小细胞外囊泡溶液。

2.根据权利要求1所述的分离方法，其特征在于，步骤S2所述尺寸排阻层析采用的固定相填料的性状为：颗粒直径40～200μm，对球形蛋白质的分离范围为10～40000kDa，对葡萄聚糖的分离范围为10～20000kDa。

3.根据权利要求1所述的分离方法，其特征在于，步骤S2所述尺寸排阻层析采用的固定相填料的性状为：颗粒直径40～165μm，对球形蛋白质的分离范围为10～20000kDa，对葡萄聚糖的分离范围为10～5000kDa。

4.根据权利要求1所述的分离方法，其特征在于，步骤S2所述尺寸排阻层析柱的柱床体积为10～11mL。

5.根据权利要求1所述的分离方法，其特征在于，步骤S2所述尺寸排阻层析收集的洗脱液总体积应至少为尺寸排阻层析柱柱床体积的1.3～1.5倍。

6.根据权利要求1所述的分离方法，其特征在于，步骤S2所述尺寸排阻层析收集对应组分的参数范围为：从洗脱开始收集，洗脱液的前42.3％-69.2％为第1组分、剩余的30.8％-57.7％洗脱液为第2组分；优选洗脱液的前42.3％-53.9％为第1组分、剩余的46.2％-57.7％洗脱液为第2组分；其中第1组分为粗小提细胞外囊泡溶液C。

7.根据权利要求1至7任一所述的分离方法，其特征在于，步骤S2所述尺寸排阻层析采用缓冲液为PBS溶液，所述PBS溶液优选经0.22μm滤膜过滤。

8.根据权利要求1所述的分离方法，其特征在于，步骤S3所述超滤浓缩的截留分子量为30～100kDa的超滤膜。

9.根据权利要求10所述的分离方法，其特征在于，超滤浓缩的条件为2800～7000×g，离心13～18min。

10.根据权利要求1所述的分离方法，其特征在于，步骤S1中所述离心去除细胞碎片血小板的条件为15000～17500×g，离心18～24min。