[发明专利]一种基于尺寸排阻层析与超滤结合的细胞外囊泡分离方法在审

专利信息
申请号: 202010649797.3 申请日: 2020-07-08
公开(公告)号: CN111961637A 公开(公告)日: 2020-11-20
发明(设计)人: 崔毅峙;吴彩红;王通 申请(专利权)人: 暨南大学
主分类号: C12N5/00 分类号: C12N5/00
代理公司: 广州嘉权专利商标事务所有限公司 44205 代理人: 胡辉
地址: 510632 广*** 国省代码: 广东;44
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摘要:
搜索关键词: 一种 基于 尺寸 层析 超滤 结合 细胞 外囊泡 分离 方法
【说明书】:

发明公开了一种小细胞外囊泡分离方法,优化了尺寸排阻层析使用的固定相填料,并与超滤法结合作为sEVs的分离方法,克服了现有小细胞外囊泡分离方法中分离过程耗时长、需要专有设备、存在高丰度蛋白质污染、引入其他杂质、产物(sEVs)浓度较低的技术不足。本发明方法不需要采用复杂的仪器设备,大大降低了实验成本,具有更好的普及推广的意义。

技术领域

本发明涉及小细胞外囊泡分离技术,更具体地,涉及一种基于尺寸排阻层析与超滤结合的小细胞外囊泡分离方法。

背景技术

细胞外囊泡(extracellular vesicles,EVs)是从细胞膜上脱落或者由细胞分泌的双层膜结构的囊泡状小体,直径从30nm到2000nm不等,通常包裹有生物活性分子,如:蛋白质、核酸等生物大分子。EVs主要由凋亡小体、微囊泡和外泌体组成。EVs表面蛋白质具亚细胞来源特异性,可反映供体细胞类型;此外这些蛋白质赋予EVs对受体细胞的靶向性,并保护EVs在体液循环中免受吞噬清除。其中,外泌体(也被称为小细胞外囊泡,small EVs,sEVs,是200nm以下的EVs)是目前学界研究的热点,sEVs是多种疾病的生物标志物,利用外周血中大量存在的sEVs有望实现癌症、病毒感染等疾病的早期诊断。然而,血清/血浆中含有大量蛋白质,其中部分蛋白质丰度极高,会对sEVs的分离及后续相关蛋白质的检测和分析造成严重干扰。因此分离sEVs和高丰度蛋白质是血清/血浆外泌体纯化技术的关键性能指标。

目前针对sEVs的纯化方法有超速离心、密度梯度离心,超滤[8],尺寸排阻层析,多聚物沉淀法以及亲和捕捉法等。

1)超速离心法(ultracentrifugation,UC)是目前纯化sEVs的金标准。该方法可实现血清中的sEVs与大部分的蛋白质分离,操作相对简单。但UC分离过程耗时长,依赖于特定设备(超高速离心机)。

2)尺寸排阻层析(size exclusion chromatography,SEC)利用球状凝胶内的筛孔,使不同大小的分子在通过不同的路径流经填料,从而在不同时间段被洗脱:大分子无法进入凝胶筛孔,运行较短路径,较早被洗脱;较小的分子可进入凝胶内的筛孔,运行较长路径,洗脱时间较长。这种分离方法可有效分离sEVs与血清中存在的高丰度蛋白质。但在SEC分离过程中,sEVs随流动相流出柱床的过程必然伴随着sEVs颗粒的稀释,影响样品的后续分析与利用。

3)多聚物沉淀法使用方便,不需要专门设备[13],适合从大体积样本中分离sEVs,已有相关产品试剂销售。但该方法在分离过程中需要引入非sEVs物质,如聚合物材料等[14],同时血清/血浆中的高丰度蛋白也可能发生共沉淀,这些杂质既影响sEVs的纯度又会对后续sEVs蛋白质相关的分析造成较大干扰。

4)亲和捕捉法可利用sEVs膜上的蛋白受体与其特异性抗体间的免疫亲和作用来达到分离sEVs的目的。该方法对分离的sEVs具较强特异性,可实现特定sEVs亚群的富集。但由于缺乏泛用性的sEVs特征性抗原,亲和捕捉法无法实现sEVs的全局性分析,应用范围较窄。

5)超滤(ultrafiltration,UF)法是一种基于尺寸差异的sEVs分离技术,血清/血浆中蛋白质等杂质与sEVs在颗粒直径上存在较大差异,可利用特定截留大小的膜过滤器来分离sEVs[15]。相对于UC,UF耗时较短,且不需要特殊设备。但由于高分度蛋白质在离心力作用下的团聚现象影响过滤效率,UF对蛋白质与sEVs的分离效果并不理想。

综上所述,现有分离方法均无法从血清/血浆中快速分离出高纯度sEVs。

发明内容

本发明的目的在于提供一种结合分子排阻层析和超滤的sEVs分离方法,该方法具以下特点:sEVs分离速度快;分离过程不依赖专有设备;不引入非样品来源杂质;蛋白质杂质容纳能力强且残留量少;sEVs产物浓度高。

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