[发明专利]嵌合南非2型口蹄疫病毒多表位基因猪细小病H毒样颗粒的制备方法及应用在审
| 申请号： | 202010651532.7 | 申请日： | 2020-07-08 |
| 公开（公告）号： | CN111793650A | 公开（公告）日： | 2020-10-20 |
| 发明（设计）人： | 张杰;丁耀忠;马维民;李茜;代军飞;汪洋;李国秀;侯谦;马炳;李苗苗;刘永生;张永光 | 申请（专利权）人： | 中国农业科学院兰州兽医研究所 |
| 主分类号： | C12N15/866 | 分类号： | C12N15/866;C12N15/62;A61K39/295;A61K39/135;A61K39/23;A61P31/14;A61P31/20 |
| 代理公司： | 北京中誉威圣知识产权代理有限公司 11279 | 代理人： | 贾慧娜 |
| 地址： | 730046 甘肃*** | 国省代码： | 甘肃;62 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 嵌合 南非 口蹄疫病毒 多表位 基因 细小 颗粒 制备 方法 应用 | ||
1.嵌合南非2型口蹄疫病毒多表位基因猪细小病毒样颗粒的制备方法，其特征在于，包括重组杆状病毒rBacN(T1)2L2B4B的制备和N(T1)2L2B4B-VLPs的组装；
所述重组杆状病毒rBacN(T1)2L2B4B的制备方法，包括以下步骤:
(1)N(T1)2L2B4B基因的扩增及重组供体质粒的构建
根据昆虫细胞嗜性优化合成含有嵌合序列的质粒GS1927OP，设计引物P1/P2，扩增得到嵌合基因N(T1)2L2B4B；回收纯化目的条带N(T1)2L2B4B，将目的片段和pFastBacTMDual载体分别进行BamH I、PstI双酶切，回收清洁后连接，化学法转DH5α感受态细胞，筛选阳性克隆，提取重组供体质粒pFastN(T1)2L2B4B；
表1 引物序列及酶切位点
注：下划线处为保护碱基和酶切位点
(2)N(T1)2L2B4B重组穿梭质粒的构建与鉴定
将pFastN(T1)2L2B4B供体质粒转化至DH10Bac感受态细胞，在含有庆大霉素(7μg/m)，卡那霉素(50μg/mL)，四环素(10μg/mL)，IPTG(40μg/mL)和X-gal(100μg/mL)的固体LB平板上37℃倒置培养48h进行蓝白斑筛选，挑取白色菌落，置于三种抗生素液体培养基中摇菌；抽提DNA，以M13F/R载体通用引物进行PCR检测，筛选阳性克隆杆粒，命名为rBacmidN(T1)2L2B4B，并提取rBacmidN(T1)2L2B4B重组杆粒，用于细胞转染；
(3)N(T1)2L2B4B重组杆状病毒的获得与鉴定
将rBacmidN(T1)2L2B4B杆粒转染生长状态良好的sf9细胞，28℃恒温培养箱培养36～72h，待出现细胞病变后，收集上清，获得阳性重组杆状病毒，命名为rBacN(T1)2L2B4B。
2.根据权利要求1所述的N(T1)2L2B4B-VLPs病毒样颗粒的制备方法，其特征在于：使用毒株rBacN(T1)2L2B4B感染HF细胞进行重组蛋白N(T1)2L2B4B表达，27℃无CO2细胞摇床125r/min震荡培养72h；离心收集细胞，超声破碎得到重组蛋白后，使用蔗糖密度梯度离心纯化后收取样品，得到N(T1)2L2B4B-VLPs病毒样颗粒。
3.嵌合南非2型口蹄疫病毒多表位基因猪细小病毒样颗粒在制备SAT2 FMDV储备疫苗的应用。
4.嵌合南非2型口蹄疫病毒多表位基因猪细小病毒样颗粒在制备PPV的新型疫苗的应用。
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