[发明专利]嵌合南非2型口蹄疫病毒多表位基因猪细小病H毒样颗粒的制备方法及应用

说明书

本发明根据计算机软件模拟结果，在猪细小病毒PPV VP2蛋白Loop2区和Loop4区后嵌入SAT2FMDV B细胞表位(VYTKAAAAIRGDRAALAAKYAD TNHTLPPTFNFGYVTVDK)，N端嵌入两个T细胞表位(NVQEGRRKHTDVAFLLDRST)串联。根据昆虫细胞嗜性优化合成嵌合基因GS1927OP，克隆到载体pFastBac^TMDual上，转化感受态细胞DH10Bac，获得重组杆粒rBacmidN(T1)2L2B4B，转染sf9细胞收获重组杆状病毒rBacN(T1)2L2B4B，用其感染HF细胞，使用间接免疫荧光IFA针对嵌合表位和VP2蛋白进行检测，具有特异性荧光。Western‑blot针对B、T细胞表位和VP2蛋白进行检测，在72KDa出现一条特异性条带。透射电镜TEM观察，重组蛋白N(T1)2L2B4B能够自我组装成病毒样颗粒。本发明旨在为南非2型口蹄疫制备储备疫苗，并能在此基础上达到同时预防南非2型口蹄疫和猪细小病的目的。

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，尤其是一种嵌合南非2型口蹄疫病毒多表位基因猪细小病毒样颗粒的组装及应用。

背景技术

南非型(Southern Africa Territories，SAT)FMDV是口蹄疫病毒属的成员。从历史上 看，SAT FMD从未蔓延过赤道，一些学者认为南非的口蹄疫传播需要非洲特殊的生活环 境。目前，SAT FMD尚未在中国发生，中国的FMD研究仅限于O，A，C和Asia 1型，SAT FMD的研究包括检测技术，疫苗研究处于空白状态。

猪细小病毒(Porcine parvovirus，PPV)属于细小病毒科，细小病毒属，能导致初产母猪及血清学阴性的经产母猪发生流产、不孕、产死胎、木乃伊胎及弱仔等。PPV一般是地方性流行，其产生抗体的过程如下：大多数母猪在分娩之前接种过疫苗，通过初乳将高水平的PPV抗体传递给仔猪，这种被动免疫在4-6个月的时间内持续处于较低水平。随着抗体的减少，仔猪被感染获得主动免疫的可能性越来越大。反复接触病毒可能会导致主动免疫持续终生。然而，由于各种各样的原因，一些母猪在初产时才会接触PPV，发生胎盘感染和生殖功能衰竭。经产母猪由于环境污染也会导致PPV再次感染。学者们认为PPV的水平传播是健康猪通过摄入或吸入携带病毒的分泌物和排泄物引起的。在大多数情况下，PPV感染不会在未怀孕的成年猪或仔猪中引起明显的临床症状，其菌株毒力的定义是它导致生殖失败的严重程度。实验和流行病学研究表明，妊娠前期PPV感染可导致生殖失败。妊娠70天后感染的仔猪会产生抗体，通常在感染后存活下来。成年公猪感染PPV时几乎没有临床症状，只有急性感染时，可以从其阴囊淋巴结和精液中分离到PPV。公猪可以作为PPV的携带者，在感染和未感染的母猪之间传播。PPV病毒粒子呈二十面体对称，直径介于20～25nm。基因组为单股负链DNA，5000bp左右，编码结构蛋白VP1、VP2、VP3。VP2拥有4个Loop环，能自组装形成病毒样颗粒(Virus-like Particles， VLPs)。Hurta-do等人分别使犬细小病毒(CPV)VP2Loop1、2、3、4内的相应基因缺失，再用杆状病毒表达系统表达，结果Loop1、3、4的缺失突变株均不能表达出VLPs，而Loop2 (217～234)的缺失突变株则能装配出规则的病毒样颗粒，进一步研究证明Loop2能容纳外源抗原决定簇，Loop2区域作为外源基因的主要插入位点组装嵌合型VLPs。现有的研究表明，VP2的N端含有甘氨酸富集区，Chen等人将其缺失，并不影响VLPs的组装，且免疫原性也不受影响。Fan将O型口蹄疫病毒(Foot and Mouth Disease Virus，FMDV)的 B细胞表位按照不同的设计缺失并插入到Loop2中，成功制备了嵌合型VLPs。Pan等人将 O型FMDV的多表位同时缺失插入到VP2的非必需区，成功构建了VLPs。他们还在VP2 的N端插入PCV2主要T细胞抗原表位，在腺病毒表达载体中成功表达出嵌合VLPs，证明了PPVVP2的N端能够容纳60个氨基酸不影响VLPs的装配。各种研究表明，PPV VP2 可以作为一种表位载体携带展示外源表位，诱导体液和细胞免疫，成为研制多表位基因工程疫苗给力工具。

发明内容