[发明专利]一种尿激酶中间体的纯化方法

权利要求书

1.一种尿激酶中间体的纯化方法，其特征在于：具体包括以下步骤：

(1)取新鲜的男性尿液，加入硅胶进行吸附，过滤后，用水冲洗硅胶，然后加氨水洗脱，收集洗脱液；

(2)向步骤(1)中得到的洗脱液加入硫酸铵进行沉淀，过滤，收集沉淀物，即得人尿激酶粗品；

(3)取步骤(2)中得到的人尿激酶粗品，溶解，过滤后经葡聚糖凝胶层析，收集洗脱液，得到尿激酶中间体粗品；

(4)取步骤(3)中得到的尿激酶中间体粗品，溶解后调节pH和电导，然后经过亲和琼脂糖凝胶层析柱，洗脱，收集洗脱液，即得高纯度尿激酶中间体。

2.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于：步骤(1)中所述的硅胶与尿液的含量比为1-5:100Kg/L；所用氨水的浓度为0.01-0.05％。

3.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于：步骤(2)中所述的硫酸铵与洗脱液的含量比为350-430：1g/L；pH值为6.0-8.0。

4.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于：步骤(3)包括如下步骤：

(31)用pH为5.0-8.0的磷酸盐缓冲溶液将人尿激酶粗品溶解后过滤，得到滤液；

(32)使用缓冲液平衡葡聚糖凝胶层析柱，平衡过程中缓冲液的pH值为6.0-8.0，电导为1-30ms/cm；

(33)将步骤(31)中得到的滤液以0.5-5mL/min速度经葡聚糖凝胶层析柱，然后加缓冲液进行洗脱，洗脱过程中缓冲液的pH值为6.0-8.0，电导为30-90ms/cm，收集洗脱液，得到尿激酶中间体粗品。

5.根据权利要求4所述的纯化方法，其特征在于：步骤(32)中所述的平衡缓冲液为醋酸盐、磷酸盐、Tris-HCl缓冲液中的一种；

所述的平衡缓冲液中还含有150-1000mM氯化钠、硫酸钠、硫酸铵或氯化镁中的一种。

6.根据权利要求4所述的纯化方法，其特征在于：步骤(33)中所述的洗脱缓冲液为醋酸盐、磷酸盐、Tris-HCl缓冲液中的一种；

所述的洗脱缓冲液中还含有150-1000mM氯化钠、硫酸钠、硫酸铵或氯化镁。

7.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于：步骤(4)包括以下步骤：

(41)用pH为5.0-8.0的缓冲液将尿激酶中间体粗品溶解后过滤，得到滤液；

(42)使用缓冲液平衡亲和琼脂糖凝胶层析柱，平衡过程中缓冲液的pH值为6.0-8.0，电导为20-60ms/cm；优选地，pH值为7.0-8.0，电导为30-50ms/cm；再优选地，pH值为7.0，电导为50ms/cm；

(43)将步骤(41)中得到的滤液以0.5-5mL/min的速度经过亲和琼脂糖凝胶层析柱，洗脱，洗脱过程中缓冲液的pH值为2.0-4.0，电导为30-90ms/cm，收集洗脱液，即得高纯度尿激酶中间体。

8.根据权利要求7所述的纯化方法，其特征在于：步骤(42)中所述的平衡缓冲液为醋酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液或Tris-HCl缓冲液中的一种；

所述的平衡缓冲液中还含有150-1000mM氯化钠、硫酸钠、硫酸铵或氯化镁中的一种。

9.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于：步骤(43)中所述的洗脱缓冲液为Tris-HCl缓冲液、醋酸缓冲液、甘氨酸缓冲液或盐酸缓冲液中的一种；

所述的洗脱缓冲液中还含有150-1000mM氯化钠、硫酸钠、硫酸铵或氯化镁。

10.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于：步骤(4)中所述的亲和琼脂糖凝胶层析柱的填料为对氨基苯甲脒琼脂糖凝胶、Benzamidine Sepharose 4FFHS/GE和Benzamidine Sepharose 6B/GE中的一种。