[发明专利]一种尿激酶中间体的纯化方法

说明书

本发明提供了一种尿激酶中间体的纯化方法，涉及生物工程、化学工程领域。具体包括以下步骤：(1)取尿液、吸附，洗脱，收集洗脱液；(2)洗脱液进行沉淀，过滤，收集沉淀物，即得人尿激酶粗品；(3)取人尿激酶粗品，溶解，过滤后经葡聚糖凝胶层析，收集洗脱液，得到尿激酶中间体粗品；(4)取尿激酶中间体粗品，溶解后调节pH和电导，然后经过亲和琼脂糖凝胶层析柱，洗脱，收集洗脱液，即得高纯度尿激酶中间体。实施过程中采用亲和琼脂糖凝胶层析，结合其他工艺条件的优化，如平衡缓冲液配方、洗脱缓冲液配方、洗脱方法、pH、电导等，使最终得到的尿激酶的活性收率提高到90％以上，纯度提高到85％以上。

技术领域

本发明涉及生物工程、化学工程领域，具体而言，本发明涉及尿激酶中间体的纯化方法。

背景技术

尿激酶是从新鲜人尿里提取的一种溶血栓药物。它能激活纤溶酶原转化为有活性的纤溶酶,纤溶酶能使不溶性的纤维蛋白转变为可溶性的肽,从而使血栓溶解。因此,临床上多用于治疗血栓形成、血栓栓塞等症。尿激酶与抗癌剂合用时,由于它能溶解癌细胞周围的纤维蛋白,使得抗癌剂能更有效地穿入癌细胞,从而提高抗癌剂杀伤癌细胞的能力。所以,尿激酶也是一种很好的癌症辅助治疗剂,而且它是无抗原性问题,可长时间使用。

尿激酶是由人肾小管上皮细胞产生的一种丝氨酸蛋白酶,是一种碱性蛋白,等电点在PH8.7左右，为白色非结晶状粉末,易溶于水。稀溶液性状不稳定,必须新鲜配用，且不得用酸性溶液稀释。冻干状态可稳定数年。尿激酶是专一性很强的蛋白水解酶。对合成底物的活性与胰蛋白酶和纤溶酶近似,也有酯酶的活力。无抗原性，不使体内产生抗体，体内半衰期为(14±6)min。

尿激酶中间体的纯化过去一直采用D-160吸附树脂，吸附树脂存在的主要问题是处理步骤繁琐，大量使用强酸强碱，环保压力大，且大体积强酸的使用对工作环境和人的伤害也比较大，并且纯度提升也很有限。

例如，中国专利申请200910186618.0中公开了一种制备尿激酶的方法，其特征在于采用了D-160阳离子树脂交换法、亲和膜色谱法及亲和层析法相结合，以尿激酶粗品为原料制备尿激酶。所得到的尿激酶质量优于现有国内水平，尿激酶比活可达到150,000IU/mg·pr以上，高分子尿激酶相对含量可达到96％以上，尿激酶生物活性回收率可达到65％。该方法中采用D-160吸附树脂，吸附树脂存在的主要问题是处理步骤繁琐，大量使用强酸强碱，环保压力大，且大体积强酸的使用对工作环境和人的伤害也比较大，并且得到的尿激酶的含量和纯度均不能满足要求。

又如，中国专利申请201611197428.5中公开了一种亲和层析纯化尿激酶的方法。具体的说，就是以健康成年男性新鲜尿液为原料，经过甲壳质吸附、吸附柱层析以及亲和层析等现代蛋白质高端生化分离技术来制备高纯度的尿激酶，可以将总收率提高到80％以上，总效价不低于40000iu/mg，但该方法操作比较复杂，其活性收率和纯度依然不能满足需求。

因此，急需一种在保证尿激酶中间体纯化过程中活性回收率的前提下，通过优化各项工艺参数如平衡缓冲液配方、洗脱缓冲液配方、洗脱方法、pH、电导等，实现了尿激酶中间体的高纯度，高活性收率，满足量产经济效益要求的尿激酶纯化方法。

发明内容

基于现有技术中存在的缺点与不足，本发明旨在提供一种尿激酶中间体的纯化方法，本发明的目的在保证尿激酶中间体纯化过程中活性回收率的前提下，采用亲和琼脂糖凝胶层析，结合其他工艺条件的优化，如平衡缓冲液配方、洗脱缓冲液配方、洗脱方法、pH、电导等条件的优化，可以明显提高尿激酶中间体的纯度和活性收率，满足量产经济效益要求。

为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案予以实现：

一种尿激酶中间体的纯化方法，本发明采用亲和琼脂糖凝胶对尿激酶中间体进行纯化，可以使尿激酶中间体的纯度提高到85％以上，活性收率提高到90％以上。

一种尿激酶中间体的纯化方法，具体包括以下步骤：