[发明专利]用于检测地中海贫血基因突变的高通量文库构建试剂盒及文库构建方法

权利要求书

1.一种用于检测地中海贫血基因突变的高通量文库构建试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括对应于待测样本中核苷酸序列的多对引物探针组、核酸外切酶、核酸连接酶和核酸聚合酶；还包括其他的建库试剂。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，每一对引物探针组分别包含5’延伸引物和3’阻滞探针；其中，

所述5’延伸引物不能被5'端方向核酸外切酶降解，所述5’延伸引物包括与目标核酸片段3'端特异性杂交的第一部分和与后续PCR扩增引物序列相对应的第二部分；

所述3’阻滞探针不能被3'端方向核酸外切酶降解，所述3’阻滞探针包括与目标核酸片段5’端特异性杂交的第一部分和与后续PCR扩增引物序列特异性杂交的第二部分；

所述多对引物探针组的序列信息如SEQ ID NO：1-98所示。

3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述核酸外切酶的修饰为硫代修饰，即所述3’阻滞探针的5'端磷酸化修饰，3'端硫代修饰；所述核酸聚合酶为高温耐热核酸聚合酶；所述核酸连接酶为高温耐热核酸连接酶。

4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述其他的建库试剂包括：

(1)DNA变性液：含有变性剂的缓冲液；

(2)引物探针混合液：用于多对引物探针组溶解在杂交缓冲液；

(3)核酸外切酶缓冲液；

(4)延伸连接缓冲液：为核酸聚合酶和核酸连接酶的PCR反应及连接反应提供反应组分及缓冲环境；

(5)延伸连接酶混合液：用于核酸聚合酶及核酸连接酶配比混合；

(6)PCR缓冲液：为核酸聚合酶提供反应组分及缓冲环境；

(7)Taq DNA聚合酶；

(8)磁珠悬浮液；

(9)磁珠洗脱液A及磁珠洗脱液B。

5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述DNA变性液组分为：0.6875×TE，pH8.0，1.25×GC solution；

所述引物探针混合液组分为：0.003μM/延伸引物，0.006μM/阻滞探针，30mM Tris-Cl，150mM NaCl，0.3mM EDTA，pH8.0，5ng/μL鱼精；

所述核酸外切酶缓冲液组分为：4.5×Exo I Buffer，20mM MgCl₂；

所述延伸连接缓冲液组分为：0.76×GC solution，3.05×HemoKlenTaq Buffer，NAD3.05mM，MgCl₂ 7.63mM，dNTP 0.61mM；

所述延伸连接酶混合液组分为：0.4μlHemoKlenTaq+0.1μl Taq DNA ligase；

所述PCR缓冲液组分为：1.65×GC buffer1，0.49dNTP，0.82mM MgCl₂；

所述磁珠纯化洗脱液A组分为：30mM KCl 10mM Tris-Cl，pH8.0；

所述磁珠纯化洗脱液B组分为：10mM Tris-Cl，pH8.0。