[发明专利]一种用于检测外泌体的DNA分子机器

说明书

本发明提供一种用于检测外泌体的DNA分子机器，由特征Substrate链和Aptamer锁定的Motor链结合在金纳米粒子(GNP)表面构成，用于荧光检测外泌体中的特异性生物标记物，进而确定外泌体的浓度。本发明通过外泌体膜上的CD63蛋白与DNA分子机器上用于锁定Motor链的CD63 aptamer的特异性识别，从而解除Motor链的锁定，Motor链和Substrate链结合，可被限制性内切酶切断Substrate链，使DNA分子机器开始运行，并释放荧光分子。本发明提供的DNA分子机器具有高特异性和灵敏性，并且成本低廉；CD63 aptamer也可被替换成其他特异性生物标志物的适配体，扩大了DNA分子机器的检测范围。

技术领域

本发明属于生物技术及医学诊断领域，具体涉及一种基于金纳米粒子(GNP)的用于检测外泌体的DNA分子机器。

背景技术

癌症是一种极其危险的疾病，可以说晚期癌症和死亡只有一步之遥。其实在癌症初期，癌症对人体的危害不大，但是肿瘤细胞能够释放某些物质，诱导血管新生；一旦产生血管，肿瘤就开始以惊人的速度生长和转移，最终造成死亡，因此癌症检测与诊断至关重要。

目前常用的癌症诊断方法有电脑断层扫描(CT)、正电子发射计算机断层扫描(PET)、B超检查、磁共振成像(MRI)和组织活检等，这些已应用于癌症诊断的方法，存在着诸如高能射线源对组织造成不可逆转的破坏、易受人为因素干扰、适用范围少、价格昂贵、不能早期筛查、有创伤或危险性较大等缺点。

外泌体作为肿瘤标记物用于癌症诊断的价值已经突显出来。外泌体是大多数细胞(包括肿瘤细胞)分泌的50-150nm细胞外囊泡。肿瘤细胞分泌的外泌体携带了大量来自亲代细胞的DNA、RNA、蛋白质等遗传物质，并参与诸如细胞间通讯、信号转导、遗传物质运输和免疫反应等生物学功能。近年来多数研究表明，外泌体与肿瘤的进展、血管生成和转移密切相关，因此它们作为潜在的肿瘤标志物和预后因素具有重要作用，为肿瘤检测的发展提供了强有力的非侵入性方法。目前较为常见检测外泌体表面标记物或内容物的技术有免疫印迹、质谱和流式细胞术。由于蛋白不能扩增，很多重要的低浓度度蛋白无法通过现有检测手段检出，蛋白检测需要寄希望于高敏感检测方法研发。

通过查阅文献得知有一种合成的DNA分子机器可以模拟蛋白质马达的功能，并且沃森-克里克碱基配对的显着特异性和可预测性使DNA成为构建合成的分子机器系统一大热门材料。但是DNA分子机器的特异性响应及自主供能等仍存在诸多限制。因此，设计一种操作简便，检测灵敏，成本低廉的DNA分子机器迫在眉睫。

发明内容

本发明要解决的技术问题是构建一种可检测外泌体浓度的DNA分子机器，具有高特异性和灵敏性，并且成本低廉。

为解决上述技术问题，本发明的实施例提供了一种用于检测外泌体的DNA分子机器，由特征Substrate链和Aptamer锁定的Motor链结合在GNP表面构成。

其中，Substrate链一端为巯基(-SH)，另一端为荧光素(FAM)。

其中，Substrate链特征序列为5’→3’：

FAM-CACCTCAGCACTTTTTTTTTTTTTT-SH。

其中，Motor链的特征序列为5’→3’：

GTGCTGAGGTGTAGCATTAGTGTCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-SH。

其中，GNP的尺寸为13～25nm。

其中，Substrate链和Motor链在GNP表面的比例为5:1～50:1。

其中，DNA分子运行能量来自于限制性内切酶Nt.BbvCI对特异性序列的切割。