[发明专利]一种鲟鱼外周血白细胞的分离方法及其分离液

说明书

本发明公开了一种鲟鱼外周血白细胞的分离方法，将鲟鱼外周血加入白细胞分离液中离心，由上至下分别为血浆层、白细胞富集层、白细胞分离液层和红细胞堆积层；收集白细胞富集层，得到鲟鱼外周血白细胞；白细胞分离液的制备方法：将Percoll原液与质量分数为8.5％的NaCl水溶液按照体积比为9：1的比例混匀，得到100％的Percoll液，再将质量分数为0.85％的NaCl水溶液与100％的Percoll液按照总体积100，体积比为33～23：67～77的比例混匀，离心转速设置为400～800×g、离心时间设置为20～30min，得到白细胞分离液。该分离方法具有操作简便、得到的白细胞数量多、存活率高的特点。

技术领域

本发明涉及一种细胞的分离方法及其分离液，特别是一种鲟鱼外周血白细胞的分离方法及其分离液。

背景技术

白细胞通过其呼吸爆发及吞噬作用参与非特异性免疫反应，在鲟鱼的免疫应答中起主要作用。鱼类的白细胞在血细胞总量中的占比较小，但其种类较多，且对鱼类的免疫功能具有重要意义。与哺乳动物类似，鱼类白细胞包括淋巴细胞、中性粒细胞等，主要通过呼吸爆发和吞噬作用介导非特异性免疫并在鲟鱼的免疫应答中起调节作用。对白细胞功能及活化机制等方面的研究一直是免疫学研究的热点，而制备高活性和高纯度的白细胞是进行这些研究的先决条件。非连续密度梯度离心法是利用不同细胞沉降系数有差异的原理，使细胞在一定离心力作用下以各自的速度沉降，从而形成区带，使得不同类型的细胞得以分离和纯化。白细胞分离液是基于非连续密度梯度离心原理设计的白细胞分离试剂，利用白细胞分离液能够获得高纯度的白细胞。但是不同分离条件对分离不同种属外周血中的白细胞活率及纯度影响很大。

根据文献报道，针对鲟鱼的外周血白细胞分离液及外周血白细胞的简易、高效分离方法尚未建立。

发明内容

本发明的目的在于，提供一种鲟鱼外周血白细胞的分离方法及其分离液。该分离方法具有操作简便、得到的白细胞数量多、存活率高的特点。

本发明的技术方案：一种鲟鱼外周血白细胞的分离方法，包括如下步骤：将鲟鱼外周血加入白细胞分离液中离心，离心管内液体出现分层，由上至下分别为血浆层、白细胞富集层、白细胞分离液层和红细胞堆积层；收集白细胞富集层，得到鲟鱼外周血白细胞；

所述白细胞分离液的制备方法如下：将Percoll原液与质量分数为8.5％的NaCl水溶液按照体积比为9：1的比例混匀，得到100％的Percoll液，再将质量分数为0.85％的NaCl水溶液与100％的Percoll液按照总体积100，体积比为33～23：67～77的比例混匀，离心转速设置为400～800×g、离心时间设置为20～30min，得到白细胞分离液。

前述的鲟鱼外周血白细胞的分离方法中，所述鲟鱼外周血与白细胞分离液的体积比为2：1。

前述的鲟鱼外周血白细胞的分离方法中，所述鲟鱼外周血为鲟鱼抗凝外周血，鲟鱼抗凝外周血是将鲟鱼外周血与抗凝剂混匀得到的，鲟鱼抗凝外周血中的鲟鱼外周血与抗凝剂的体积比为1：1。

前述的鲟鱼外周血白细胞的分离方法中，所述抗凝剂为肝素钠溶液。

前述的鲟鱼外周血白细胞的分离方法中，收集白细胞富集层的方法为用移液器逐层吸取；具体方法如下：使用移液器吸取最上层的血浆层，弃血浆层，然后吸取白细胞富集层。

前述的鲟鱼外周血白细胞的分离方法中，质量分数为0.85％的NaCl水溶液与100％的Percoll液按照总体积100，体积比为28：72的比例混匀，离心转速设置为800×g、离心时间设置为20min，得到白细胞分离液。

前述的鲟鱼外周血白细胞的分离方法中，所述鲟鱼为杂交鲟，即史氏鲟♀×西伯利亚鲟♂。

一种应用于鲟鱼外周血白细胞的分离方法中的分离液。