[发明专利]非病毒方法制备稳定高表达嵌合受体的NK细胞

权利要求书

1.一种利用非病毒转座子系统和人工抗原呈递细胞制备嵌合受体修饰的自然杀伤细胞的方法，其特征在于，所述方法包括：

(1)利用转座子系统将嵌合受体的编码基因转入自然杀伤细胞，得到初始的嵌合受体修饰的自然杀伤细胞；

(2)利用人工抗原呈递细胞扩增所述初始的嵌合受体修饰的自然杀伤细胞。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述自然杀伤细胞包括人原代自然杀伤细胞；

所述人原代自然杀伤细胞来源于外周血、脐带血或诱导性多能干细胞。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述嵌合受体包括嵌合抗原受体和/或嵌合转换受体。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述转座子系统包括piggyBac转座子系统、Sleeping Beauty转座子系统或Tol2转座子系统。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述转座子系统包括转座子元件和转座酶元件。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述转座子元件包括转座子5’反向末端重复序列和3’反向末端重复序列；

所述5’反向末端重复序列和3’反向末端重复序列之间含有两个绝缘子；

所述两个绝缘子之间含有启动子和嵌合受体的编码基因；

所述转座子元件为质粒或线性化核酸片段。

7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述转座酶元件包括转座酶蛋白或编码转座酶的核酸分子；

所述编码转座酶的核酸分子包括质粒、线性化核酸片段或mRNA。

8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述转座子元件和转座酶元件连接在同一表达载体上。

9.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述转座子元件和转座酶元件在不同的表达载体上。

10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述转座子系统通过电穿孔和/或化学试剂转入自然杀伤细胞。

11.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(1)之前还包括活化自然杀伤细胞的步骤。

12.根据权利要求11所述的方法，其特征在于，所述活化自然杀伤细胞采用人工抗原呈递细胞、饲养细胞、细胞因子、抗体或化合物进行。

13.根据权利要求11所述的方法，其特征在于，所述自然杀伤细胞活化0～14天后，将所述转座子系统转入自然杀伤细胞。

14.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(1)之前还包括利用磁分选去除CD3+细胞的步骤。

15.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(1)之后还包括将初始的嵌合受体修饰的自然杀伤细胞培养0～14天后，利用磁分选去除CD3+细胞的步骤。

16.根据权利要求1或12所述的方法，其特征在于，所述人工抗原呈递细胞包括以细胞为基础的人工抗原呈递细胞、人工合成的人工抗原呈递细胞或以外泌体为基础的人工抗原呈递细胞。

17.根据权利要求16所述的方法，其特征在于，所述以细胞为基础的人工抗原呈递细胞包括人髓系白血病K562细胞、人伯基特淋巴瘤Daudi细胞、EBV转化的B淋巴母细胞样细胞或小鼠胚胎成纤维细胞系NIH/3T3细胞。