[发明专利]非病毒方法制备稳定高表达嵌合受体的NK细胞

说明书

本发明提供了应用非病毒方法制备稳定高表达嵌合受体的自然杀伤(NK)细胞的方法及其应用，所述方法包括：(1)利用转座子系统将嵌合受体的编码基因转入自然杀伤细胞，得到初始的嵌合受体修饰的自然杀伤细胞；(2)利用人工抗原呈递细胞扩增所述初始的嵌合受体修饰的自然杀伤细胞。本发明应用转座子系统在NK细胞中引入稳定高表达的嵌合受体，与现有技术相比，本发明的方法操作简便、快速、高效、准确、重复性好、成本效益高、并有较好的安全性，由此制备的嵌合受体修饰的NK细胞具有较强的肿瘤杀伤能力，在体外展现了较好的抗肿瘤效果，在生物医学各个领域、特别是疾病的细胞治疗领域具有广阔的应用前景。

技术领域

本发明属于医学生物工程技术领域，涉及应用非病毒方法制备稳定高表达嵌合受体修饰的NK细胞的 方法及其应用。

背景技术

自然杀伤(NK)细胞是先天性免疫系统的重要组成部分，在外周血淋巴细胞中NK细胞的比例约10％， 是继B细胞和T细胞之后的第三大淋巴细胞群体。NK细胞具有多种生物学功能，是人体对抗感染和肿瘤 的第一道防线。NK细胞的功能通过精密且复杂的激活型和抑制型受体网络进行调节。大部分循环的NK 细胞处于静息期，可以被细胞因子活化并浸润到病原体感染或含有恶性细胞的组织中。当NK细胞的受体 与相应的配体结合后，NK细胞还可以分泌一些细胞因子，例如干扰素(IFN)-γ，发挥免疫调节作用。 NK细胞的主要功能之一是对机体进行免疫监督，研究者已发现NK细胞参与控制多种疾病的发生发展。 对哺乳动物细胞(包括人体细胞)的一些体外研究以及对小鼠和大鼠的体内研究表明，NK细胞可以将肿瘤细胞识别为靶标，并在体内控制肿瘤细胞的生长、转移和扩散。一项为期11年的随访流行病学调查显 示，外周血NK细胞活性降低会增加成人患癌症的风险。不仅如此，体外实验和动物实验还发现，NK细 胞对SARS、H5N1、埃博拉、寨卡、登革热、HIV等多种突发病毒感染疾病具有良好的抑制和消除能力。

与MHC限制的T细胞不同，NK细胞不需要进行HLA配型，因此可以作为异源性的现货细胞药品 对病人进行免疫治疗，在临床上具有重要的应用前景。基于自体或同种异体NK细胞的过继性疗法在临床 上已经应用于抗肿瘤、抗病毒感染，特别是异体NK细胞对于治疗血液系统癌症显示出良好的治疗效果。

尽管NK细胞具有强大的免疫效应功能，但是许多癌细胞和病毒会通过抗原逃逸和免疫抑制等机制来 抑制NK细胞的功能。由于这些原因，在过去的十年时间中，科学家们一直在探索通过基因工程的方法来 增强NK细胞的功能活性并避免免疫抑制，例如通过表达内源性细胞因子来增强过继回输后的NK细胞的 增殖能力，抑制免疫抑制信号或增强NK细胞的杀伤功能等。后一种方法目前主要通过修饰嵌合抗原受体 (CARs)使NK细胞重新定向于肿瘤细胞。嵌合抗原受体是将抗体的ScFv与胞内信号转导结构融合在一 起，ScFv用于介导识别和结合肿瘤细胞表面抗原。

然而，原代NK细胞对于基因转染的抵抗力较强，这导致NK细胞对多种载体系统的摄取率低，NK 细胞的转基因表达量低，只有病毒载体在原代NK细胞中实现了较高的基因转移效率。目前，对原代NK 细胞进行嵌合受体的修饰一般通过电转嵌合受体编码基因的mRNA或者采用慢病毒/逆转录病毒感染的方 式来实现。mRNA电转只能使嵌合受体编码基因瞬时表达，且体外合成mRNA的成本较高，临床上需要 多次注射，治疗费用较高。慢病毒/逆转录病毒转染则可以制备嵌合受体基因稳定表达的NK细胞，然而 与NK细胞株如NK92比较，原代NK细胞、尤其是外周血NK细胞感染难度极大，迄今为止，只有少数 科研团队成功应用慢病毒/逆转录病毒制备嵌合抗原受体修饰的原代NK细胞，经多次重复感染后，其转 基因在终产品中的表达比例在20％～80％之间，其中逆转录病毒的转染效率高于慢病毒。然而，由于逆转 录病毒和/或慢病毒本身是致病原，具有插入突变的潜力，对人类临床试验的实施构成了重大的监管障碍。 不仅如此，在细胞系中大规模制造病毒载体存在成本高、效率低的问题，对嵌合受体修饰的NK细胞的临 床转化构成了障碍，显著提高了生产成本。